探索大脑中的精细连接 |《自然》技术特写|em|神经元|秀丽隐杆线虫|细胞|自然

Moritz Helmstaedter希望将小鼠大脑中的7000万个神经元全部绘制成图。在他还是德国海德堡大学医学生的时候，该校的精神病学专家认为人类心理的某些方面缺乏生物学解释。Helmstaedter现在是德国法兰克福马克斯·普朗克大脑研究所的所长，他回忆说：“当时这种观点让我感到非常震惊。“

尽管大脑仍然是个谜，但Helmstaedter坚信大脑里发生的事情“最终必定归因于某种机制，尽管其机制可能非常复杂”。在过去的二十年中，他一直致力于解决这些问题，并且他和其他神经科学家终于开始触及“冰山”的表面——一次一立方微米。

追踪神经连接（例如果蝇大脑）可以揭示神经结构、生物学与疾病间的联系。

自1970年代开始，科学家们花了十多年的时间才弄清一毫米长的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的神经回路。为探究基因与行为之间的关系，英国剑桥MRC分子生物学实验室的生物学家Sydney Brenner和他的同事花费了大量的时间和精力来追踪每个神经细胞的细小分支和突触连接，并在数千张电子显微照片上手动对它们进行颜色编码。该连接图是动物神经系统中第一个也是唯一一个完整的突触连接集，被存储在一台房间大小的计算机上，并作为第一个完整的动物“连接组”于1986年发表在一部340页的出版物中[1]。

秀丽隐杆线虫的神经元少于400个；而人类大脑的神经元有860亿个。因此，目前科学家们正致力于到达线虫和人类之间的里程碑：绘制小鼠的精细神经回路[2]。

马萨诸塞州剑桥市哈佛大学的神经科学家Jeff Lichtman是全球联盟的领导者之一，该联盟致力于在未来十年重建小鼠大脑的神经连接，他说，即使小鼠大脑细胞比人类少了约1000倍，绘制其连接图也面临着巨大的挑战。“我们正在处理的是一个十亿兆字节（EB）级的数据集。”1EB等于十亿个十亿字节（GB），整个人类基因组的大小约为1.5GB。他说：“从数据量来说，绘制小鼠大脑连接组是一个巨大的项目，连接组非常复杂。”

然而，完成这个项目所需的技术几乎已经到位了。随着显微技术和人工智能（AI）的发展，以及“在线玩家”的众包支持，研究人员开始以史上最高的分辨率和规模绘制神经网络及其连接图。在过去的几年中，包括哺乳动物视网膜片段和大脑皮层片段在内的小部分大脑区域，已经成为人们关注的焦点。2020年9月，果蝇研究人员报道了迄今为止最大的重建图[3]：半脑中的25000个神经元，这是一个边长为250微米的立方体组织，占果蝇大脑的40％。

这些不仅仅是大生物学中的练习项目。随着连接组推动技术和计算突破极限，研究人员希望利用这些数据集来研究经验如何在大脑中存储，以对自闭症，精神分裂症和其他神经连接疾病产生新的见解。

- Maxim Balukov -

早期进展

Helmstaedter说，在秀丽隐杆线虫的神经接线图于1986年启动连接组学之后，该领域沉寂了下去。这里有一个技术问题：除了Brenner团队所用的方法，研究人员没有其他办法在连接组规模上探索神经回路。

在2000年代初期，还是一名博士生的Helmstaedter将电极插入神经细胞中，以找出哪些细胞是通过电信号连接的，这种方法可能允许同时记录四个或五个神经元。然而，神经网络有成百上千的神经细胞和数百万个连接。他说：“要真正绘制神经回路图，我们还需要其他方法。”

2004年，当时在海德堡的马克斯·普朗克医学研究所的Winfried Denk和他的同事们，在电子显微镜（EM）的真空室中安装了一种被称为“薄片切片机”的精密切割工具，从而实现了纳米级的自动化成像。这一技术使连接组学领域焕然一新[4]。

Denk的方法被称为连续切片扫描电子显微镜（SBEM），该方法是将一块组织样品置于机器中，自动对样品最上层进行成像，然后刮下最上层再成像，重复这一过程乃至几天或几周。2013年，由实验室前博士后Helmstaedter领导Denk的团队，使用SBEM绘制了小鼠视网膜中950个神经元的完整的突触连接图[5]。这是一项艰巨的任务：项目总花费为200万欧元，包括设备，薪酬，和支付给本科生以跟踪整个EM数据集的神经回路所需的费用（约30万欧元/35万美元）。这项工作揭示了新的细胞亚型。除此之外，还为研究人员提供了一幅全面的图谱，用以确定与感兴趣的细胞相互作用的细胞，Helmstaedter说：“就像使用地图进行导航，而非不断地试错”。

蠕虫数学

学生通过计算机追踪这些神经回路。这种转变始于2000年代初，研究人员开始使用计算机方法绘制连接组。这不是机器学习，工作仍然是人干的。但不同于Brenner团队当初在纸上用彩色铅笔追踪神经元，他们用鼠标点击大量的数字化图像来进行追踪。

例如，纽约市阿尔伯特·爱因斯坦医学院的生物学家Scott Emmons和他的团队将Brenner的原始图像数字化，并利用计算机方法来绘制调控雄性秀丽隐杆线虫尾部交配行为的神经回路图。（1986年的工作重点是秀丽隐杆线虫的雌雄同体。）

秀丽隐杆线虫成虫的大脑连接组（本视频无声音）

D. Witvliet et al./bioRxiv

然后，Emmons聘请统计学家应用图论（数学的一个分支，用于分析诸如公交路线或疾病传播图等网络）来计算突触连接的强度，并确定连接组网络的哪些部分驱动特定行为。Emmons说，尽管数学家研究人工神经网络已有数十年之久，但2012年报道的秀丽隐杆线虫研究被认为是对自然神经网络的首次定量分析[6]。

为了继续推进这一领域的研究，Emmons和同事于2019年发表了[7]秀丽隐杆线虫两性完整神经系统的定量连接组，包括了687个神经元。目标之一是确定雄性和雌雄同体之间的神经连接的差异性。但是，将性别差异与个体间的自然生物学差异区分开来并非易事，这需要更多的数学知识，因此导致论文的发表推迟了一年。最终，研究小组得出结论，Emmons说，多达30％的神经连接可能反映出基于性别的真正差异，而不是由后天条件或方法错误引起的差异。

预料之外的复杂性

通过小蠕虫的大脑来追踪神经回路需要数以千计的30-50纳米的切片。加拿大多伦多大学的神经科学家Mei Zhen说：“就算是神也没法毫无失误地切出5000个切片。”

现在要尝试的是，将无失误切出5000个切片的过程重复8次。在5月bioRxiv预印本文章[8]描述的一项分析中，由Zhen，Lichtman和哈佛物理学家Aravinthan Samuel领导的研究人员重建了秀丽隐杆线虫的八个发育阶段的连接组，以了解其神经连接如何随着从早期幼虫到成虫的发育而发生变化。他们使用Lichtman实验室开发的自动胶带收集超薄切片机对大多数样品进行了切片，该切片机收集连续切片并将它们按顺序放在卷盘上，以便随后通过扫描电子显微镜成像[9]。Zhen说，它“将蠕虫变成一卷胶带”。

利用这一技术，研究团队检测到蠕虫神经连接中的巨大差异。Zhen说，即便在基因相同的实验动物中，仍有大约43%的神经连接差异。

- Tianhua Mao -

在MRC分子生物学实验室，系统神经科学家Marta Zlatic研究了另一种蠕虫样生物：果蝇幼虫。果蝇幼虫长4–8毫米，比秀丽隐杆线虫大，其大脑神经元数量比成年果蝇少10-20倍。Zlatic说：“因此，我们可以更快地重建神经回路，并且可以在许多个体中进行重建。” Zlatic将连接组学与其他技术相结合，以将神经结构与功能进行关联。

在2020年3月发表的一篇文章中，Zlatic的团队分析了102对与避开异味有关的神经元[10]。他们发现即便在这些小昆虫中，广泛分布的神经网络也可以调控学习过程。她说：“当动物学习到关于某种气味的新知识时，它学习的速度和程度将受到它所学到的其他一切关于该种气味的知识的影响。”

机器学习

将此类分析拓展到能够进行高阶学习的动物（例如成年果蝇或小鼠）更具挑战性。但对这些动物的分析，也正在取得进展。

在2019年的一项研究中，Helmstaedter和同事利用SBEM对小鼠大脑内负责处理感觉信号的区块进行成像和重建[11]。该区块体积为50万立方微米，包含约 2.7米的神经线路和40万个突触连接，虽然仅包含89个神经元，但比之前哺乳动物大脑皮层的重建模型大300倍。

Helmstaedter估计，用当时的标准技术重建这些神经回路——逐个切片手动追踪每个神经细胞——将花费数十万小时。因此，他的团队将自动图像处理算法与机器学习的人工智能方法相结合，人力主要负责标记神经元分支，而计算机主要负责体积重建。这将工作量减少到20000小时，仍相当于10个人全职工作一年。通过训练计算机对重建结果进行评估并仅在需要时请求人工帮助，这些对人工智能的进一步改进加快了重建过程。

与此同时，弗吉尼亚州霍华德休斯医学研究所（HHMI）珍利亚农场研究园区的研究人员将目光投向了果蝇。珍利亚的应用物理学家Shan Xu说，果蝇大脑的神经元比小鼠大脑少得多，但它的神经回路更细密。完整的追踪这些连接需要8纳米的分辨率，这是Xu在2009年加入HHMI时扫描EM分辨率的3-6倍。他说，考虑到当时的技术水平，仅成像就需要十年时间。

- Igor Degtyarev -

这还不是最大的挑战。为了以这种分辨率跟踪每个神经元过程，图像必须是完美的；100纳米的误差可能就会导致数据不可用。Xu说：“你真心希望运行一台机器10年不出错。”

Xu花费数年苦心调查故障模式和触发故障的条件。“在它出问题之前，有什么明显的迹象？我可以捕捉到并立即停止操作的指标有哪些？并且怎样才能顺利的断点重启呢？”Xu没有追求完美，而是选择利用人工智能，构建了一个可以在计算机故障、真空泵故障或其他故障出现时自行关闭的系统。Xu说，这种思维方式的转变“完全改变了局面”，帮助他的团队改进了另一种切面成像技术FIB-SEM，该技术使用聚焦离子束而不是切片机进行切片，并生成高质量的高分辨率图片[12]。

Xu和同事并行运行了两个这样的FIB-SEM系统大约两年。在计算机收集了大量的EM图像后，一个由50名HHMI员工组成的团队全职工作了一年来校对这些图像。每天仔细观察数千张图像后，校对人员很快学会了如何发现错误——例如那些连接不正确的图像或需要连接的孤立图像。珍利亚的分析开发人员和资深校对员Erika Neace说：“你可以根据所观察的神经元类型来训练自己的眼睛。”该团队总共追踪了25000个神经元和它们在半脑中的2000万个连接[3]。

另外，珍利亚的另一个团队使用透射电子显微镜（TEM）对果蝇大脑进行了成像，这是一种较旧的技术，可以让电子通过薄样品，而不是像FIB-SEM那样扫描表面。将显微镜与一系列相机和机械组件安装在一起，以更高的速度处理更大的标本，他们对整个成年果蝇大脑进行了成像[13]。然后，他们通过仔细追踪蕈状体（一种对学习和记忆很重要的大脑结构中的神经回路），对TEM得到得106TB数据进行了验证。

- James O'Brien -

如今，研究人员利用众包的形式来进行注释，使用人工智能和人类志愿者创建在线游戏作为精细连接组学的试验台。8月，由新泽西州普林斯顿大学神经科学家Sebastian Seung和Mala Murthy领导的研究人员发布了一个名为FlyWire的类游戏平台，该平台展示了来自珍利亚的果蝇脑数据集中由AI识别的神经元片段，供玩家组装[14]。以Eyewire（早期由Seung 实验室开发的一款使用较小的小鼠视网膜图集的游戏）为基础，FlyWire通过允许多个用户同时查看和编辑同一数据集中的神经元，补充了谷歌的Neuroglancer可视化平台。

与Xu的半脑重建由内部校对团队处理不同，FlyWire的重建处理通过所有玩家的贡献共同完成。Seung说，随着时间的推移，这些贡献会改进系统。当用户通过单击按钮来分割或合并片段来编辑神经元时，该操作会发送一条消息，训练机器检测错误的重建，并随着时间的推移纠正它们。Lichtman说：“这是一个非常深刻、充满哲学趣味的时刻。通过研究更智能的生物机器的神经回路，机器正在学习变得更聪明。”

目前，Seung正在与德克萨斯州休斯顿贝勒医学院和华盛顿州艾伦脑科学研究所的研究人员合作，旨在建立一个新的在线社区Pyr（Pyr into the brain），以重建更大的小鼠大脑区域。10月，由Clay Reid和Nuno da Costa领导的艾伦研究所团队描述了用于收集这些数据的方法。该团队用大视场相机和定制的卷对卷样本处理系统改装了6个1980 年代生产的TEM，在6个月内对1立方毫米的小鼠视觉皮层进行了成像，产生了2PB 的数据[15]。现在，该团队正在寻求如何将他们的操作扩展到全脑水平，艾伦研究所协助成像流程开发的科学家Wenjing Yin说，“我们需要解决很多问题。”

连接组在线社区的工作将停止，但大约有7000万个小鼠神经元仍然未知。对此Helmstaedter持乐观态度：“对于开拓新领域来说，这是一个非常激动人心的时刻，总会带来那么多惊喜。”

参考文献

1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. & Brenner, S. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 314, 1–340 (1986).

2. Abbott, L. F. et al. Cell 182, 1372–1376 (2020).

3. Scheffer, L. K. et al. eLife 9, e57443 (2020).

4. Denk, W. & Horstmann, H. PLoS Biol. 2, e329 (2004).

5. Helmstaedter, M. et al. Nature 500, 168–174 (2013).

6. Jarrell, T. A. et al. Science 337, 437–444 (2012).

7. Cook, S. J. et al. Nature 571, 63–71 (2019).

8. Witvliet, D. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.04.30.066209 (2020).

9. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W. & Terasaki, M. Methods Cell. Biol. 152, 41–67 (2019).

10. Eschbach, C. et al. Nature Neurosci. 23, 544–555 (2020).