撰文｜xiao xia
胰腺腺癌（PAAD）是一种致命的恶性肿瘤，其5年生存率不到10％，是癌症相关死亡的第七大原因，在2018年占全球癌症死亡的4.5％。
尽管mRNA疫苗对多种癌症有效，但其对胰腺腺癌（PAAD）的疗效尚不明确。越来越多的证据表明，免疫分型可以反映肿瘤及其免疫微环境的综合免疫状态，这与肿瘤的治疗效果和疫苗接种潜力密切相关。
基于此，浙江大学医学院附属第一医院浙江省胰腺疾病重点实验室梁廷波教授带领团队，通过鉴定胰腺腺癌（PAAD）的有效抗原，以开发mRNA疫苗，并进一步区分PAAD的免疫亚型，为选择合适的患者进行疫苗接种构建免疫景观。
该项工作以：Identification of tumor antigens and immune subtypes of pancreatic adenocarcinoma for mRNA vaccine development 为题，近日在线发表于Molecular Cancer期刊上。
为了确定胰腺腺癌（PAAD）的潜在抗原，研究团队首先筛选了异常表达的基因，并检测了2459个可能编码肿瘤相关抗原的过表达基因。
突变分析表明，KRAS原癌基因GTPase（KRAS）和肿瘤蛋白p53（p53）在改变的基因组分数和突变计数方面是最常发生突变的基因。值得注意的是，除了KRAS、p53和二酰甘油激酶β外，还有anoctamin 1等7个基因也都具有相同的突变频率，表明它们之间可能存在基因组相互作用。总的来说，该研究共鉴定出926个过度表达和频繁突变的肿瘤特异性基因（图1）。
图1. PAAD潜在肿瘤抗原的鉴定
接下来，研究者从上述基因中筛选与预后相关的肿瘤抗原，作为开发mRNA疫苗的候选基因。21个基因与PAAD患者的OS密切相关，其中7个基因与RFS显著相关。在肿瘤组织中过表达ADAM金属肽酶结构域9（ADAM9）的患者与ADAM9低表达组相比生存期显著缩短。同样，高表达的Ephrin B2（EFNB2）、MET、TMOD3、TPX2、WNT7A也与预后不良有关（图2）。
图2. 鉴定与PAAD预后相关的肿瘤抗原
此外，ADAM9、EFNB2、MET和TMOD3的高表达水平与巨噬细胞、DC和B细胞的肿瘤浸润增加显著相关。TPX2和WNT7A在免疫细胞浸润增加中也表现出上调趋势，尽管它们的表达水平变化较大。这些结果表明，已鉴定的肿瘤抗原可能被APCs直接处理并呈递给T细胞，并被B细胞识别，从而触发免疫应答，因此有望开发抗PAAD的mRNA疫苗（图3）。
图3. APCs相关肿瘤抗原的鉴定
由于免疫分型可以用来反映肿瘤及其微环境中的免疫状态，从而帮助确定合适的患者进行疫苗接种。因此，研究者分析了ICGC数据库中239个PAAD样本中1997个免疫相关基因的表达谱，构建了一致性聚类。根据它们的累积分布函数，研究者选择了免疫相关基因稳定聚集的k = 5（图4a和b），并获得了5个指定为IS1-IS5的免疫亚型（图4c）。IS1和IS2与较好的预后相关，而IS3的生存概率最低（图4d）。
不同肿瘤分期和分级的亚型分布表明，诊断为分化期的患者不规则地聚集在一起（图4e），而分级为1和4与IS1显著相关（图4f）。与ICGC队列获得的结果一致，免疫亚型在TCGA队列中也与预后相关（图4g），并且在不同阶段显著改变（图4h），并且分级为1和4与IS1有很大的相关性（图4i）。
图4. 鉴定PAAD的潜在免疫亚型
更高的肿瘤突变负荷（TMB）和体细胞突变率与更强的抗癌免疫力相关。因此，研究者使用经mutect2处理的TCGA突变数据集计算了每个患者的TMB和突变，并对所有免疫亚型进行了分析。如图5a所示，IS4和IS5的TMB明显高于IS1、IS2和IS3。突变基因的数量也出现了类似的趋势（图5b）。
此外，包括KRAS在内的11个基因在每个亚型中最常发生突变（图5c）。这些结果表明，免疫亚型可以预测PAAD患者的TMB和体细胞突变率，IS4和IS5患者可能对mRNA疫苗有积极反应。
图5. 免疫亚型与TMB和体细胞突变之间的关联
鉴于免疫检查点（ICP）和免疫原性细胞死亡（ICD）调节剂在肿瘤免疫中的重要性，研究者接下来分析了它们在不同亚型中的表达水平。在两个队列中检测到47个ICPs相关基因，其中ICGC队列中的41个（87%）基因（图6a）和TCGA队列中的46个（97.9%）基因在免疫亚型之间差异表达。ICGC组ICPs的总体表达水平高于TCGA组。在ICGC队列中检测到28个ICD基因，其中22个（78.6%）在免疫亚型中差异表达（图6c）。同样，25个ICD基因在TCGA队列中表达，其中24个（96%）在亚型之间表现出显著差异（图6d）。因此，免疫分型可以反映ICPs和ICD调节剂的表达水平，可以作为mRNA疫苗潜在的治疗生物标志物。
图6. 免疫亚型与ICP和ICD调节剂之间的关联
CA125和CA199是确定PAAD的预后和诊断标志物，两者的较高水平表明癌症进展、预后不良或癌症复发。在这项研究中，ICGC和TCGA队列在不同免疫亚型的CA199和CA125表达水平上显示出显著差异。例如，在ICGC队列中，IS1以及IS3和IS4分别显示出较高的CA199和CA125表达（图7a和b），而IS2和IS4分别显示TCGA队列中较高的CA199和CA125表达（图7c和d）。此外，CA199和非CA125在两个队列中的差异表达相对一致，表明CA125水平对生物或环境因素高度敏感。总之，免疫亚型在预测PAAD患者预后方面优于CA199和CA125。
图7. 免疫亚型与CA199和CA125之间的关联
对mRNA疫苗的反应取决于肿瘤的免疫状态。因此，研究者通过使用ssGSEA对TCGA和ICGC队列中先前报道的28个特征基因进行评分，进一步描述了5种免疫亚型中的免疫细胞成分。这些结果表明，免疫亚型反映了PAAD的免疫状态，可以确定合适的患者进行mRNA疫苗接种。带有这些抗原的mRNA疫苗可诱导免疫性“不敏感”IS4和IS5肿瘤患者的免疫浸润。这些发现不仅证明了研究者的免疫分型方法的可靠性，而且扩大了先前的分类标准。
图8. 免疫亚型的细胞和分子特征
接下来，研究者通过个体患者的免疫基因表达谱用于构建PAAD的免疫景观（图9a）。如图9b所示，水平轴与各种免疫细胞相关，其中效应记忆CD8 T细胞、1型辅助性T细胞和滤泡辅助性T细胞呈最负相关，而垂直坐标与未成熟DC呈最负相关。IS1的积分分布与IS4和IS5的积分分布相反。此外，对免疫环境中具有极端分布位置的样本进行预后比较，第6组患者显示出最佳存活概率，这与上述结果一致（图9e和f）。
综上所述，基于免疫亚型的免疫景观能够准确识别每个PAAD患者的免疫成分并预测其预后，有利于选择个性化的mRNA疫苗治疗方案。
图9. PAAD的免疫景观
免疫基因共表达模块通过WGCNA（图10a）聚类样本进行鉴定，无标度网络的软阈值为4（图10b和c）。然后将表示矩阵转化为邻接矩阵，再转化为拓扑矩阵。研究者采用平均连锁层次聚类法，每个网络至少有30个基因，遵循杂交动态剪切树的标准。计算每个模块的特征基因，将接近的模块合并为一个新的模块，高度 = 0.25，深裂 = 4，最小模块大小 = 30。如图10d所示，研究者获得了10个与1997个转录本共表达的模块，其中灰色模块中的基因没有与其余的基因聚类（图10e）。研究者进一步分析了5种免疫亚型在9个（灰色除外）模块的特征基因中的分布，并在8个模块中检测到显著不同的分布（图10f）。因此，IS5对应于免疫性感冒，IS1则对应于炎症性肿瘤。
图10. PAAD免疫基因共表达模块的鉴定
研究者通过进一步的预后相关分析显示，蓝色和绿色模块与PAAD的预后显著相关（图11a）。此外，蓝色模块与T细胞活化有关，但与免疫景观的组分1呈负相关（图11b和c）。同样，与白细胞迁移相关的绿色模块也显示出一致的负相关（图11d和e）。对蓝色模块的预测相关基因的分析表明，在ICGC和TCGA队列中，较高的表达分数与较好的预后相关，这与上述发现一致（图11f和g）。肿瘤组织中T细胞和其他免疫细胞的浸润和活化，以及对免疫抑制细胞的抑制，在很大程度上决定了mRNA疫苗对特定免疫亚型癌症患者的治疗潜力。因此，mRNA疫苗可能不适用于高表达基因聚集成蓝色和绿色模块的患者。
图11.PAAD免疫中枢基因的鉴定
综上所述，该研究团队在胰腺腺癌（PAAD）中发现6种过度表达和突变的肿瘤抗原，包括ADAM9、EFNB2、MET、TMOD3、TPX2和WNT7A，与预后不良和抗原呈递细胞浸润有关。此外，PAAD的5种免疫亚型（IS1-IS5）和9种免疫基因模块在两个患者队列中都是一致的。免疫亚型表现出明显的分子、细胞和临床特征。与其他亚型相比，IS1和IS2表现出免疫激活表型，并与更好的存活率相关。IS4和IS5肿瘤在免疫上是不敏感的，并且与较高的肿瘤突变负荷有关。免疫原性细胞死亡调节剂、免疫检查点以及CA125和CA199在五种免疫亚型中也有差异表达。因此，ADAM9、EFNB2、MET、TMOD3、TPX2和WNT7A是开发抗胰腺腺癌 mRNA 疫苗的有效抗原，IS4和IS5肿瘤患者适合接种。
论文链接：
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-021-01310-0
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