基于细胞的疗法正在成为修复受损组织（例如，神经，骨骼，软骨和皮肤）的一种有前途的策略，而有效递送细胞是基于细胞疗法的再生医学的前提。然而，当前基于向受损组织中或静脉内直接注射细胞（或细胞聚集体）的细胞递送方法遭受细胞滞留率低的问题，需要重复注射。此外，注射过程中对细胞的机械损伤可诱导细胞凋亡，进一步阻止了积极的治疗作用。因此，有必要开发生物材料辅助细胞递送系统来应对上述挑战。然而，当前具有不合适的细胞相容性和拓扑结构的细胞递送载体在注射期间仍然表现出差的细胞活力。
近日，北京大学熊春阳/北京大学口腔医院赵玉鸣、葛立宏通过将乳液技术与梯度冷却冷冻凝胶法相结合，由甲基丙烯酸明胶（GelMA）制备了多孔形状记忆晶胶微球（CMS）。通过改变梯度冷却程序，可以轻松调整CMS的孔径。可注射的GelMA CMS具有多孔结构，理想的细胞相容性，增强的细胞分化潜能和有效的多种细胞类型递送能力，使其成为移植治疗性细胞以进行组织再生的合适细胞递送载体。相关工作以“Injectable GelMA Cryogel Microspheres for Modularized Cell Delivery and Potential Vascularized Bone Regeneration”为题发表在《Small》上。
【GelMA CMS的制备】
在这项研究中，为了制造GelMA CMS，首先使用W / O乳液将GelMA溶液转化为GelMA球体。冷冻凝胶化之前的冷却速度会影响起致孔剂作用的冰晶的大小，在冷冻过程中其已从水相中析出，而较低的冷冻温度会导致较小的孔。因此，研究人员设计了一种梯度冷却冷冻凝胶技术，以获得具有不同孔径的GelMA CMS。梯度冷却过程分为以下两个步骤：1）在-20°C下低的速率成核，以及2）在液氮中的高速率成核。作为对照，GelMA水凝胶球（HMS）的表面是光滑的。相比之下，通过新颖的冷却程序制造的CMS显示出互连的微孔。根据冷却速率，CMS-0，CMS-30和CMS-60的平均孔径分别为4.5±1.3 µm，15.5±6.0 µm和28.8±14.5 µm。延长的冷冻时间导致冰晶过度生长，并导致孔径与粒径之比高以及微孔形态分布不均。
通过乳液技术与梯度冷却冷冻凝胶相结合的方式制备CMS
【体外评估hBMSC细胞负载】
在本研究中，培养1到3 d后，在载有hBMSC的微球中检测到了粘附蛋白标志物vinculin。在CMS-30上培养的hBMSC表现出最强的绿色荧光，其次是CMS-0。相反，HMS组中纽蛋白的阳性表达相当弱。通过SEM观察粘附细胞的形态 。在第1天在CMS上观察到hBMSC的均匀分布和典型的极化纺锤形。在随后的时间点，细胞表现出更多的伪足并在孔壁中扩散。相比之下，粘附在HMS上的hBMSC表现出扁平形态，伪足很少。特别是，一些细胞已经长入CMS-30和CMS-60的孔中。
hBMSC细胞贴附表征
微球的多孔结构有利于细胞附着并为细胞增殖提供更大的表面积。由于附着力更好，第1天CMS-0和CMS-30的光密度（OD）值略高于其他组。从第1天到第7天，在所有微载体中检测到连续细胞生长，OD值的顺序为CMS-30> CMS-0> CMS-60≈HMS。活/死染色结果显示，强烈的绿色荧光证实了这些附着的细胞在增殖过程中是活的，而几乎没有红色荧光（代表死细胞）被检测到，表明GelMA具有出色的生物相容性。
hBMSC细胞增殖表征
【CMS的可注射性，形状记忆和细胞保护能力】
可注射生物材料的应用明显减少了手术伤口的大小并降低了感染的风险。使用26G注射器针头（内径0.25 mm）注射CMS-30，该针头比用于批量冷冻凝胶注射的常规针头（16G）要细得多。除了可以微观尺寸和相互连接的微孔外，CMS-30的形状记忆能力在注射过程中进一步保护细胞。研究人员设计了“注射后细胞存活”（PCS）实验。注射前，大量细胞附着在各种微球的表面，然而，在PCS实验之后，观察到粘附在不同微载体上的细胞数量存在显着差异。注射后，HMS和CMS-0表面的活hBMSC的绿点数量明显减少。尽管进行了PCS实验，但在CMS-30上培养的hBMSC的绿色荧光却没有明显减少，相应的吸光度差异显着低于其他值（0.01），这归因于优异的细胞粘附性，优化的孔径和形状记忆保护细胞的协同效应。进一步培养24小时后，检测到连续细胞生长，证明注射后细胞具有活力。
CMS细胞注射过程中对细胞的保护
【体外评估HUVEC细胞负载及细胞模块化培养】
具有种子HUVEC的微载体的细胞骨架染色显示，微载体表面的HUVECs连续增殖7 d，具有明显的丝状肌动蛋白细胞骨架。通过SEM证实了具有独特的多边形形态的附着的HUVEC。与hBMSC一样，CMS-30表现出对HUVEC的粘附，增殖和扩散的最佳促进作用。PCS实验也在载有HUVEC的微载体上进行。预培养3天后，绿色荧光表示CMS-30的活细胞数量最高，注射后6小时，HMS和CMS-0微球表面的细胞数量显着减少，吸光度差约为0.09。但是，CMS-30和CMS-60的绿色荧光和OD值仅略有下降，说明了孔径较大的微载体对细胞的保护能力。培养24小时后，还检测到HUVEC持续生长。
体外评估HUVEC细胞负载
CMS-30有助于在长时间的体外培养中保持hBMSC的干性结果表明，并可以通过添加诱导因子来促进hBMSC的成骨分化。进一步，进行了鸡胚绒毛膜尿囊膜（CAM）分析，以评估以1：1比例结合两种细胞类型的递送系统的血管生成能力。
CMS-30上培养的hBMSC的干性，成骨分化。模块化递送系统成血管能力
【皮下注射细胞负载的CMS-30和异位血管样骨再生】
为了评估移植细胞的生命力和功能以及生物材料的生物学特性，大鼠皮下注射模块化双细胞递送系统（hBMSC / HUVEC / CMS-30），以1：1的比例结合了hBMSC加载的CMS-30和HUVEC加载的CMS-30，已经形成了丰富的新血管，Masson的三色染色法将大量相互连接的钙化骨样组织染成深蓝色和红色，血管化骨样组织的成熟度更高。在hBMSCs / HUVECs / CMS-30组中，OCN和CD31的表达最高。在再生骨样组织中，hBMSC和HUVEC的协同作用被认为发挥了重要作用。
皮下注射细胞负载的CMS-30和异位血管样骨再生评估
总结
总而言之，研究人员通过将乳液技术与梯度冷却冷冻凝胶相结合来制造GelMA CMS。具有多孔结构的CMS显示出生物相容性和注射能力。CMS‐30具有15.5±6.0 µm的最佳孔径和形状记忆功能，可促进hBMSC和HUVEC的粘附，在持续7 d的时间内保持高水平的持续增殖，并在注射过程中保护细胞。在小鼠中，以1：1的比例皮下注射hBMSC负载的CMS-30和HUVEC负载的CMS-30后2个月，实现了成骨和血管生成。这归因于注射部位的靶向递送和长期保留。由于它们在构建模块中的应用灵活性，可注射的GelMA CMS有望在多细胞递送和功能性组织再生领域中广泛应用。将来，通过电流体动力喷涂或微流体方法制造的GelMA CMS也可以与梯度冷却冷冻凝胶工艺结合使用，以创建用于精密医疗应用的CMS库。
来源：高分子科学前沿
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