【第三届检验与临床（血液与体液）案例展示全国决赛稿件】
作者 | 陈楠，陈朴，王蓓丽，潘柏申，郭玮
单位 | 复旦大学附属中山医院
01
前 言
细胞毒治疗后髓系肿瘤（myeloid neoplasms post cytotoxic therapy，MN-pCT）是出现在肿瘤或非肿瘤患者接受细胞毒药物化疗或者放疗后的罕见晚期并发症。该病起病常较隐匿，且易与化放疗导致的造血异常及血细胞减少混淆。
2022年造血与淋巴组织肿瘤WHO分类将治疗相关髓系肿瘤（myeloid neoplasms post cytotoxic therapy，MN-pCT）更名为MN-pCT，并将MN-pCT与胚系易感性髓系肿瘤归为继发性髓系肿瘤。
MN-pCT包括了细胞毒治疗后急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukaemia post cytotoxic therapy，AML-pCT）、细胞毒治疗后骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes post cytotoxic therapy，MDS-p-CT）和细胞毒治疗后骨髓增生异常综合征/骨髓增殖性肿瘤（myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms- post cytotoxic therapy，MDS/MPN-pCT）[1]。
MN-pCT相关报道较少，尤其是非霍奇金淋巴瘤进展为MN-pCT的相关报道更少见，并且MN-pCT患者预后差，死亡率高[2]。故提高对该病的认识，做到早发现、早诊断、早治疗显得尤为重要。
02
案例经过
患者，女，57岁，2017年诊断为“滤泡淋巴瘤”于外院行6个周期的R-CHOP（利妥昔单抗+环磷酰胺+表柔比星+长春新碱+泼尼松）化疗，完全缓解后观察随访。2020年10月3日因排尿困难以及发现“腹盆腔淋巴结肿大，压迫输尿管”，考虑淋巴瘤复发首次收入我院。
完善骨髓及病理检查后，明确为滤泡淋巴瘤(follicular lymphoma, FL))复发。但当时即在外周血和骨髓中均观察到单核细胞数量增多。患者在接受BR（利妥昔单抗+苯达莫司汀）化疗后情况稳定出院。
2020年11月11日患者再次入院化疗，血常规结果显示红细胞和血小板进一步减少，而白细胞计数升高，呈现典型的“两低一高”。血常规镜检报告34%原幼细胞，临床初步疑诊为疾病进展淋巴瘤细胞浸润，但形态上不甚符合，且伴单核细胞比例明显升高。
再次完善骨髓细胞形态学、免疫学、细胞遗传学，明确为克隆性髓系来源原始细胞，最终患者诊断为细胞毒治疗后急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukaemia post cytotoxic therapy，AML-pCT）。
03
检验案例分析
既往史：2017年患者当地医院诊断“滤泡淋巴瘤”，行6个周期RCHOP（利妥昔单抗、环磷酰胺、表柔比星、长春新碱、泼尼松）方案化疗后完全缓解。
01
初次入院
2020年10月3日患者因排尿困难，行CT检查提示“腹盆腔淋巴结肿大，压迫输尿管”考虑淋巴瘤复发，收入我院。
入院后完善相关检查，如下：
1、多次血常规检查：血红蛋白108~110g/L；血小板计数（55~96）×109/L；白细胞计数（5~13）×109/L；单核细胞比例逐渐升高14%~19%。
2、骨髓细胞形态（见图1）：骨髓增生活跃，髓象中粒、红、巨三系增生减低。片中可见41.5％异常幼稚细胞（箭头所示），此类细胞大小不等，大多约为10-15微米；部分细胞核呈圆形，部分胞核可见凹陷，扭曲，核染色质细致略紧；胞浆量较少，部分胞浆可见细小颗粒。POX染色（见图2）：（+/-）3%，（+）1%，（-）96%。外周血可见幼粒细胞，单核细胞比例偏高。
注：箭头所示为异常细胞
图1骨髓涂片（瑞氏-吉姆萨染色×1000）
图2 骨髓涂片 （POX染色×1000）
3、骨髓细胞免疫分型（见图3）：CD19POS/CD20POS设门，见33%的细胞表达CD10、CD38、CD22，不表达CD5、CD23、CD200，Kappa限制性表达，Lambda不表达。
图3 骨髓流式细胞学可见轻链限制性克隆B细胞
4、骨髓活检提示：符合B细胞淋巴瘤累及骨髓，伴单核细胞明显增生。
5、骨髓染色体：复杂核型：50,XX,+1,add(1)(p11),add(3)(p22),add(4)(q31),
add(8)(p11.2),t(14;18)(q32;q21),+mar1,+mar2,+mar3,inc[cp2]/46,XX[17]。
图4 染色体核型分析
6、骨髓FISH检查：IGH::BCL2(见图5)：nuc ish（BCL2，IGH）×3，（BCL2 con IGH×2）[100/200]；MYC（见图6）：nuc ish（3’MYC，5’MYC）×2，（3’MYC sep 5’MYC×1）[80/200]
注：箭头所示为基因融合细胞
图5 IGH::BCL2融合基因阳性（FISH检测×1000）
注：箭头所示为基因分离细胞
图6 MYC分离基因阳性（FISH检测×1000）
综上，患者诊断为FL复发，临床给予BR治疗：利妥昔单抗600mg，苯达莫司汀125mg d1-2。患者情况稳定后出院。
02
再次入院
2020年11月11日患者为行治疗第二次收入我院。
1、血常规：血红蛋白：74g/L；血小板计数：80×109/L；白细胞计数：29.25×109/L；单核细胞百分比：33.0%；原始细胞能见34%。
2、骨髓细胞形态（见图7）：骨髓增生明显活跃，原幼细胞约占73.5%，此类细胞大小约10~20um，细胞大多呈圆或椭圆形；核染色质细致，能见扭曲折叠；胞浆中等偏多，呈灰蓝色；粒、红二系增生受抑。考虑急性髓细胞性白血病，倾向M5可能。POX染色（见图8）（+/-）44%，（+）10%，（-）46%。
注：箭头所示为原幼细胞
图7骨髓涂片（瑞氏-吉姆萨染色×1000）
图8 骨髓涂片（POX染色×1000）
3、骨髓细胞免疫分型（见图9）：CD45/SSC设门，46%的细胞表达CD13、CD33、CD64、HLA-DR、11b，不表达CD34、CD14、CD15及淋系标志。CD19POS/CD20POS设门，Kappa和Lambda未见限制性表达。
图9 骨髓流式细胞学见大量幼稚细胞伴髓系标记
4、骨髓活检提示急性髓细胞性白血病；
5、染色体核型（见图10）：46,XX,?t(9;11)(p22;q23)[10]/46,XX[10]。
图10 染色体核型分析
由于经济因素患者拒绝行基因检测。
综合病史及相关检查，诊断为AML-pCT。
患者初次入院后完善相关检查，骨髓细胞形态学（Morphology）见45%异常细胞，此类细胞与常见初发FL细胞形态不甚相同，大小不一，核染色质略致密，核形常有扭曲、凹陷，胞浆量少，部分浆内可见细小颗粒。
考虑是否为FL向高级别淋巴瘤转化可能，结合免疫学(Immunology)提示有轻链限制性，且表达CD10、CD38、CD22，不表达CD5、CD23、CD200符合FL免疫表型；骨髓活检亦提示B细胞淋巴瘤累及骨髓；细胞遗传学（Cytogenetics）提示为复杂核型，且包含FL中常见的t（14；18）的易位；分子生物学（Molecular）有IGH::BCL2的融合及MYC的分离，结合患者MICM综合诊断考虑FL存在分子遗传学异常驱动疾病进展复发无异议。
但同时为何患者外周血随访多次单核细胞比例升高，且骨髓涂片中亦提示单核细胞多见，这是存疑的一个地方。
患者再次入院时，外周血涂片单核细胞比例明显升高已高达33%，且出现34%原幼细胞，细胞形态似髓系来源。由于患者初次骨穿及此次骨穿形态差异大，我们甚至怀疑患者骨标本信息的准确性，经过仔细核对确认标本无误。
患者此次入院行骨髓细胞形态学提示有73%原幼细胞浸润，与初入院时的细胞形态不同，已不再是幼稚样的淋巴细胞，此类细胞体积偏大，染色质细致，可见扭曲折叠，胞浆由之前的深蓝色变成了现在的灰蓝色，此次倾向于急性髓细胞白血病可能。于是我们加做了POX染色，结果显示部分细胞呈阳性或弱阳性，结合骨髓细胞形态学诊断该患者为急性髓细胞性白血病，倾向FAB分型急性单核细胞白血病（M5）。
我们及时与检测骨髓免疫分型的同事联系，了解到临床考虑该患者转化为侵袭性淋巴瘤可能，仅开具淋系相关标志物。于是我们及时与临床沟通后加做髓系相关标志物。
随后免疫学分型结果提示B细胞无轻链限制性，可见大量幼稚细胞伴髓系表达；并且几天后的骨髓病理诊断与之相符同样考虑急性髓细胞性白血病；细胞遗传学由原来的复杂核型转变成了如今单核细胞白血病易出现的染色体核型改变；基因检测虽然患者拒绝，但是通过染色体易位的位点来推断该患者KMT2A：：MLLT3基因融合可能。
结合此次患者入院的MICM诊断，考虑患者诊断为急性髓细胞性白血病，结合患者之前的治疗史考虑患者为AML-pCT。为何自患者初次入院以来单核细胞持续增高？考虑患者可能是处在继发为单核细胞白血病的克隆演变过程中。
04
临床案例分析
FL是非霍奇金淋巴瘤中最常见的一种类型，来源于滤泡生发中心细胞，为低恶性B细胞肿瘤。国内发病率占NHL的8.1%~23.5%。FL的诊断主要基于包括形态学和免疫组化检查在内的组织病理学检查，必要时参考流式细胞术及细胞遗传学检查结果。
根据世界卫生组织（WHO）淋巴瘤分类方法，FL按照每高倍镜视野中心细胞及中心母细胞的数量可以分为1~3级。1级：每个高倍镜视野内中心母细胞个数0～5个；2级：每个高倍镜视野内中心母细胞个数6～15个；3级：每个高倍镜视野内中心母细胞个数>15个，其中，仍保留少数中心细胞为3A级，成片中心母细胞浸润，不见中心细胞者为3B级。
低级别FL（1级和2级）治疗若干年后部分患者可能转化为侵袭性淋巴瘤，如伯基特淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤等侵袭性淋巴瘤，但主要为弥漫大B细胞淋巴瘤，年发生率为2~3%，预后较差。该患者初次入院完善的MICM相关检查可除外转化为侵袭性淋巴瘤可能，仍然诊断为FL复发。利妥昔单抗治疗复发FL患者的有效率可达45%左右，完全缓解率6%，可提高挽救化疗方案，因此此时的挽救化疗方案我们选择了BR方案。
患者再次入院行第二次挽救方案治疗，入院时血常规提示两高一低，外周血涂片能见到原幼细胞，首先考虑患者为FL向侵袭性高级别淋巴瘤转化可能，故开具淋系相关检查。患者骨穿后血液实验室老师及时与我们沟通，考虑急性髓细胞性白血病后，骨髓免疫分型我们加做了髓系标志物。
免疫分型结果符合急性髓细胞性白血病。后续的骨髓活检及染色体核型分析均提示为急性髓细胞性白血病，而非FL转化的侵袭性淋巴瘤。考虑患者既往有化疗病史，故患者最终诊断为AML-pCT。
05
知识拓展
MN-pCT占髓系肿瘤的10%~20%，任何年龄均可发病，其中与恶性肿瘤治疗相关的患者约占80%，非恶性肿瘤患者接受细胞毒药物治疗或者自体造血干细胞移植患者占5%~20%。恶性肿瘤中实体肿瘤治疗患者占70%，其中乳腺癌患者最常见，血液系统肿瘤患者占30%。
MN-pCT发生机制尚不明确，原发疾病治疗后进展为MN-pCT是一个极其复杂的过程。2022年造血与淋巴组织肿瘤WHO分类认为克隆性造血（clonal hematopoiesis，CH）是MN-pCT的相关风险因素[1]。
早前有研究发现，意义未明的克隆性造血（Identifying clonal hematopoiesis of indeterminate potential，CHIP）是进展为MN-pCT的基础，使肿瘤治疗患者更容易受到年龄、原发病、放化疗药物、药物应用时间及剂量的影响，各种因素相互作用影响药物代谢及基因修复，从而导致疾病的发生[2-4]。
MN-pCT发生机制尚不明确，有文献报道由于基因多态性造成的遗传易感性，影响药物代谢及基因修复，从而导致疾病的发生。有文献报道与年龄、原发病、放化疗药物、时间、剂量等相关。MN-pCT中位生存期（OS）仅8~10个月，5年OS占10~20%，明显短于原发性髓系肿瘤[2]。
引起MN-pCT的药物主要分为以下两类:烷化剂和拓扑异构酶II抑制剂[5]。烷化剂包括环磷酰胺、马法兰等，是第一类用于治疗肿瘤的化疗药物，与DNA发生烷化反应，抑制DNA的合成，影响细胞分裂。
拓扑异构酶II抑制剂包括依托泊苷、表柔比星、米托蒽醌等，是通过稳定并延长DNA酶断裂复合物的半衰期，干扰DNA复制及转录，从而起到杀伤细胞的作用。由于作用机制、药物剂量、药物应用时间的不同，二者引起的MN-pCT无论是潜伏期、临床表现、骨髓细胞学、细胞遗传学及还是分子生物学方面均有差异。
烷化剂相关MN-pCT潜伏期往往4~7年，MN-pCT多以MDS表现起病，往往有一系或多系细胞的形态异常，原始细胞比例往往＜5%，细胞遗传学多出现复杂核型，且以5和7号染色体部分缺失、单体及P53突变多见[6]。此类患者预后较差，中位生存期不到1年。
拓扑异构酶II抑制剂相关MN-pCT潜伏期较短约1~5年，起病即为AML，无MDS相关改变，外周血原始细胞比例较高。细胞遗传学方面多涉及11号染色体的易位，其中以t（9；11）易位较多见，形态上多表现为粒-单核细胞白血病或单核细胞白血病的特征。也可见t（8；21）及t（15；17）和inv(16)的重排，形态上多类似于伴染色体异常的原发性急性白血病，此类患者预后相对烷化剂相关MN-pCT好。
引起MN-pCT的药物除了烷化剂和拓扑异构酶II之外还包括放疗、抗代谢药物、细胞因子及新型靶向药物，放疗所致MN-pCT患者在临床表现、细胞遗传学及分子生物学方面多与烷化剂所致MN-pCT相似，其余药物由于多与化疗药物联合使用，致MN-pCT作用较难分析。
06
案例总结
本案例患者3年前因FL行6个周期R-CHOP化疗时使用了烷化剂环磷酰胺以及拓扑异构酶II抑制剂表柔比星。3年后初次入院时，其骨髓涂片、骨髓流式及影像学检查结果均提示淋巴瘤复发，但当时外周血单核细胞已出现升高端倪，且染色体核型分析提示复杂核型，考虑可能正处在克隆演变的过程中。
患者再次入院时，外周血单核细胞明显升高，并见原幼细胞。随后的骨髓细胞形态及免疫分型均进一步提示为AML-M5，且染色体核型分析未见前次淋巴瘤特异的t(14;18)，而是发现MN-pCT常见的t(9;11)（p22；q23）易位，均符合拓扑异构酶II相关t-MN的表现，综合考虑诊断为AML-pCT，高度提示预后不良,需要应用分子靶向药物及干细胞移植等个性化治疗方案。
07
专家点评
点评专家：陈朴 复旦大学附属中山医院检验科
随着医疗技术的发展，肿瘤患者能够获得的治疗方案选择日渐丰富。在众多针对肿瘤的治疗方式中，以放疗和化疗最为常见。但由于放化疗的杀伤作用会使体内DNA损伤及造血环境持续异常，而治疗手段的多样化也使肿瘤患者的治疗周期及生存期均大幅延长，随之而来可能会发生罕见且复杂的疾病转归。MN-pCT这一既往罕见的远期并发症也越来越多地受到关注。作为一个新型疾病种类，MN-pCT的诊断除了了解治疗史外，完善的实验室MICM检查不可或缺。正如本例患者，在快捷直观的形态学诊断中发现异常，与临床及时沟通，调整检查方向为髓系肿瘤相关检测指标，通过免疫分型及染色体核型分析明确肿瘤类型，综合病史、治疗史得以确诊，大大节约了时间与经济成本，也使患者能够在此基础上尽早获得精准的个性化治疗方案。
【参考文献】
[1]. CREE IA. The WHO Classification of Haematolymphoid Tumours. Leukemia 2022; 36(7):1701-1702.
[2]. WENGE DV, WETHMAR K, MIKESCH JH, et al. Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation for therapy-related myeloid neoplasms following treatment of a lymphoid malignancy. Leuk Lymphoma 2021; 62(8):1930-1939.
[3]. VOSO MT, FALCONI G, FABIANI E. What's new in the pathogenesis and treatment of therapy-related myeloid neoplasms. Blood 2021; 138(9):749-757.
[4]. KUZMANOVIC T, PATEL BJ, SANIKOMMU SR, et al. Genomics of therapy-related myeloid neoplasms. Haematologica 2020; 105(3):e98-e101.
[5]. DHAKAL P, PYAKURYAL B, PUDASAINEE P, et al. Treatment strategies for therapy-related acute myeloid leukemia[J]. Clin Lymphoma Myeloma Leuk, 2020, 20(3):147-155.
[6].ORNSTEIN M C, MUKHERJEE S, MOHAN S, et al. Predictive factors for latency period and a prognostic model for survival in patients with therapy-related acute myeloid leukemia[J]. Am J Hematol, 2014, 89(2):168-173.
说明：本文为原创投稿，不代表检验医学新媒体观点。转载时请注明来源及原创作者姓名和单位。
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编辑：徐少卿 审校：陈雪礼
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