有机体的生命活动需要不同器官或组织的协调来执行相应功能，在生命的基本单元—单个细胞中，细胞活动的过程也由一系列信号转导的分子事件控制。信号转导过程是由蛋白激酶和蛋白酶进行的一系列磷酸化和去磷酸化引起的细胞活动事件。此外，不同器官之间通过信使分子进行的协调本质上也是蛋白质，蛋白质是生命活动的执行者。合成具有独特氨基酸序列的蛋白质的信息由存在于细胞核内的核酸所编码。在预设特定的氨基酸序列中，存在于细胞核中的 DNA 会产生特定的 信使RNA 序列，进而引导细胞机器合成对应序列的蛋白质。
1958 年，Francis Crick在发现DNA双螺旋结构之后，提出了中心法则概念，“The central dogma of molecular biology deals with the detailed residue-by-residue transfer of sequential information. It states that such information cannot be transferred back from protein to either protein or nucleic acid”。分子生物学的中心法则解释了遗传信息的流动，从DNA到RNA,再到蛋白质，也包括信息不会从蛋白质流向核酸的概念，当然近些年这也有几个例外，中心法则的内容也在不断更新完善中。
中心法则各环节引百家争鸣
中心法则的每一个环节，都吸引生物学家们不断探索，遗传信息的复制，转录，翻译，调控，从基因组学到转录组学，再到蛋白组学和代谢组学，从组织器官到细胞群体再到单个细胞研究。作为生命活动的基本结构单元，单个细胞是研究中心法则的最佳模型。不同组织的细胞结构和功能迥异，同一组织的细胞虽然结构功能类似，通过单个细胞的组学研究，依然具有多样的异质性。探索中心法则的组学技术发展，依赖于两条技术路线，一条依赖于核酸捕获扩增，反转录，蛋白检测等分子生物学，免疫学技术的升级，另一条是细胞分隔，从手工操作低通量到自动化高通量并行技术的发展。
单细胞基因组学—分子生物学不断突破
单细胞基因组学非常好的诠释了分子生物学技术的不断进步对单个细胞水平上研究细胞间基因组变异和功能理解的全面性。单细胞基因组的技术关键在于无偏差的对全基因组进行扩增（whole – genome amplification WGA），通过对引物的优化创新，和新的工具酶的挖掘，以及扩增条件的新策略，单细胞基因组的捕获效率逐渐升高，包括1992年开始的依赖含有15个碱基的随机引物的PEA技术，以及采用含有6个随机引物的兼并序列引物的DOP-PCR，到2003年基于phi29DNA聚合酶的MDA方法，2012年Sunny Xie开发的MALBAC技术，后来基于Tn5转座子的LIANTI技术，减少了非特异扩增和指数扩增，大大降低了扩增偏差，促进了肿瘤研究和临床诊断，尤其是循环肿瘤细胞的分析，对胚胎发育的研究，神经元的理解都有重要作用。
单细胞转录组学
——生物学和微流控交叉的典范
单细胞转录组学的发展则向我们展现了分子技术和微流控技术交错更迭，相互促进的优秀风貌。在cDNA的扩增上，经历了从末端加尾、体外逆转录到模板置换的方法发展，2006年，通过 Oligo-dT 引物反转单个细胞中的 mRNA 获得一链 cDNA，再使用末端加 A 的策略获得双链 cDNA，由于当时还没有二代测序，使用基因芯片杂交获得了转录本的信息，2009年，汤富酬教授沿用了该策略，配合SOLID 测序平台，完成了第一个正真意义上的单细胞测序，随后拉开了单细胞转录组测序的浪潮。一方面是对末端加尾方法的优化，如Quartz-seq，另一方面是对新的高效二链合成方法的开发如CEL-seq，Smart-seq，以及Barcode和UMI的策略让高通量成为可能，从Quartz-seq到Quartz-seq2。基于TSO的模板末端置换法依赖于其高效简便的二链合成方案，如今已经成为cDNA扩增的主流技术。
当一项组学技术其重要性得到生物学家们的认识后，人们开始利用材料学，微流控等交叉技术构建新的高通量平台。15年以前，单细胞转录组测序还仅仅是在96/384孔板中进行，基于油包水的微流控芯片技术和Barcode以及UMI的巧妙结合，让高通量单细胞转录组学大放异彩，在10XGenomics进入中国市场之后，单细胞转录组学的应用文章如雨后春笋般涌现。单细胞转录组学的本质是对每个细胞都打上独一无二的标签，利用标签区分每个细胞中的转录组信息。同时基于Microwell的单细胞转录组学技术同样有其一席之地。另外，SPLiT-seq技术以细胞为反应腔室，通过固定细胞打孔，进行多轮split-and-pool的方案在96孔板上就可以实现高通量的单细胞转录组分析。单细胞转录组方法在高通量的发展过程中，隔离腔室引物配对经历了从显微操作、96/384 孔板到油包水滴，再到纳米微孔以及固定细胞内腔的发展，在通量和可行性提高的同时，成本也逐渐下降，目前已经成为肿瘤，免疫，发育等多个应用领域的标配。
单细胞蛋白组学—依赖技术创新
考虑到蛋白质是生命活动的执行者，对于蛋白质的检测，在生物学上则较为清晰，大体基于抗原抗体结合的Assay或者基于质谱的分析。而想要在单细胞水平上进行蛋白组学方面的研究，则依赖于流式，微流控等平台的整合和创新。通过抗体偶联荧光标签，对细胞的表面蛋白和部分胞内蛋白检测，而全光谱染料的出现和金属标签修饰抗体的加入，扩大了单个细胞可以检测蛋白的种类数量，此外还有单细胞Western等技术。这些都是基于细胞本身的蛋白表征，而细胞分泌的产物同样是细胞非常重要的功能指标和细胞间信息传递的要素。Isoplexis的单细胞平台利用蛋白条码标签可以实现单个细胞多个分泌物质的检测。
破译中心法则需论因果
从受精卵到一个生物个体的发育，即起源于一套遗传物质，但却能分化为形态各异，功能多样的细胞类型，而每一种细胞类型通过遗传物质的调控以及和环境的互作，最终形成了组织和器官等复杂结构和功能，这便是中心法则的魅力。中心法则是一个动态调控的连续过程，单一组学反应了某个时间点下细胞某一层面的信息，这一层面的信息对于细胞来说，要么是因，要么是果，而因果很难联系。比如单细胞转录组学，发表的文章大多是组织器官，微环境等表达图谱或者细胞聚类文章，我们知道了某个器官或者疾病类型表达图谱，或者细胞类型，这是因，然后由于缺乏后续蛋白质等层面的功能分析，很难在实际研发生产中有所建树。故大多数单一组学的数据都沉睡在不同影响因子的文章里，单细胞转录组学既没有在临床诊断中有所发现，也没有在药物靶点发现上广泛应用，而只是体现在了文章的影响因子上，随着文章越来越多，这一发文捷径也昭然若揭，不再起效。
即获得因，又拿到对应的果，则要求我们能够同时获得中心法则中各个层面的信息，即单细胞多组学的核心需求。而商家是最早嗅到这一商机的，10xGenomics和MissionBio都推出了基于Total-seq的蛋白联合转录组或基因组的技术，10xGenomics 的 Single Cell Multiome ATAC + Gene expression也已经上市，BD同样推出了结合单细胞测序的多组学平台，同时，2022年6月，率先将光谱流式细胞术与可分选成像相结合推出新品BD FACSDiscoverTM S8 细胞分选仪。通过整合光谱流式细胞术与实时空间和形态学信息，将细胞分析和分选的能力扩展到新维度而广受追捧。2021年于荷兰创立的UFO Biosciences，筛选、识别、分离和分析单细胞的服务，以找到真正有意义的基因。UFO Biosciences 革命性功能性单细胞测序技术的基础工作发表在 Nature Biomedical Engineering。功能性单细胞测序可以在单细胞水平上将细胞表型与其驱动基因型直接联系起来。通过对大量细胞的实时行为显微成像分析，我们可以识别出表现攻击性行为的异常细胞。我们可以挑选并测序以了解驱动这些侵袭性细胞特定表型的分子途径。细胞的攻击行为是果，侵袭性细胞的驱动基因是因，因果联系，再遇到同样的果，就能从源头通过改变因来达到效果。
组学已至，联动在技
以上举到的例子，有膜蛋白和基因组，转录组联系的，有细胞成像行为和膜蛋白的联系或者和转录组的联系，局限于技术的法则，这些信息往往呈现某个局部特征，很难从中心法则的全局上获得较为全面的联动数据。
然而，尴尬的是中心法则的每一层的技术，不管是基因组，转录组，蛋白组，细胞功能成像等，我们都有非常完备的方法独立获得，唯一要做的是将他们联系起来。前面提到，当生物学技术足够完善的时候，想要突破，就需要依赖于交叉学科例如微流控，材料，化学等多方面的结合。拿到单个细胞的每一个层面的信息非常简单，而想要将他们联系起来，则需要物理方法的连接，这就对单个细胞的操控提出了新的需求。因此，彩科（苏州）生物科技有限公司提出了能够实现单细胞多组学的平台画像：
对成千上万个单细胞进行高度并行的自由操作，包括特定的细胞导入和导出
可以对细胞进行多维度的成像和实时监控，具有多个荧光通道，可实现多个蛋白的检测。
高通量并行的单细胞可以实现长时间的培养及换液
能够对高通量的单细胞进行染色，清洗
可以并行导入高通量的单个磁珠同细胞配对，以捕获各种组学信息
能够对某些感兴趣的细胞进行分选导出分析其各种组学信息
多组学量身定制-光电镊千变万化
目前，对于单细胞的检测系统而言，样本从常规的组织变成了单个细胞，这就对检测灵敏度提出了新的要求，而微流控技术以其极小的反应体积，大大提高检测灵敏度，同时减小前处理中操作者带来的误差。微流控中单细胞操控的技术非常丰富，各种物理场都有很好的应用，包括通过流体驱动的单细胞阱、微阀门形成的单独反应器、电镊、光镊以及声镊等。
单细胞分析的本质，就是将单个细胞独立分隔，目前常用的两类方案为微阵列和微孔。微孔阵列在基因测序和单分子蛋白检测中都有应用，基因测序的主流方法是边合成边测序（Sequencing By Synthesis），在合成的过程中检测碱基的信号，无论何种信号的检测，都对微流控芯片提出了两个要求，分别是物理分隔的反应位置和可连续进行反应（Sequential Reaction），微孔阵列不仅可以通过泊松分布实现微球和细胞配对，也可以通过液体交换对细胞进行染色等反应进行实时监测，但由于微孔只有物理分隔的作用，对于细胞的提取复杂繁琐；而采用油包水的液滴方案，将液滴和微球等反应物包裹在液滴中同样达成了物理上的分隔，而且可以使用流体或电场控制液滴通过控制液滴的移动来控制细胞的移动，这样可以解决微孔阵列中无法操控细胞的问题，却失去了连续反应的能力。由于水相反应物都被包裹在油中，如果需要增加反应物要在液滴的芯片上做液滴的融合，如果需要彻底改变反应物，则需要破乳后重新形成液滴，理论上虽然可以实现，但从产品化的角度，每一种不同的应用或细微的改变都需要重新设计液滴芯片并进行大量工程验证优化等工作，难以实现单细胞多组学上多样的应用需求。
液滴的方法中有一种基于介电润湿的数字微流控技术，利用介电润湿效应驱动液滴动作的原理在于通过对嵌在介电层下的微电极阵列施加电压来改变介电层与附着于其表面导电液滴间的润湿特性，使液-固接触角发生变化，造成液滴两端不对称形变，促使液滴内部产生压强差，从而实现对液滴变成或运动的操作与控制。注意，介电润湿的技术在于移动液滴，通过移动包裹细胞的液滴来移动细胞。因此，同样存在液滴捕获细胞的问题，单细胞的捕获一方面可以通过有限的对称分裂实现，也可以搭载十字油包水的液滴挤出系统（液滴数字微流体ID2M）实现，前者步骤繁琐，而后者依赖于泊松分布，捕获效率低下，加之可变液滴的移动稳定性尚待研究，数字微流体在高通量单细胞分析上不占优势。
最终，基于光电镊的技术，通过可见光照射光敏材料诱导产生非均匀电场介电泳力， 推动Beads或细胞移动。这个方法可以结合上述方法中的优势，通过对百万级以上的光敏像素点的数字化控制，可以实现直接对于细胞和Beads的高度并行操控，同时可以对细胞的环境进行换液加样，进行连续的多种的反应，并通过成像方式实时监测细胞状态和增殖情况。
目前，国内唯一拥有该技术的是彩科（苏州）生物科技有限公司（以下简称：Lychix彩科生物）。
单细胞光导系统TARS
光导芯片Partition
Lychix彩科生物单细胞光导系统TARS，基于高度集成的纳升级细胞微环境光电芯片，实现了高通量单个细胞的显微成像，高自由度单个细胞的并行操控，高效率的细胞生长环境的液质及气体的交换，细胞长时间的培养追踪，以及任意视野下，指定细胞的自动分选导出，为广泛的科研工作者提供了细胞操作分析分选相关的一系列的完整解决方案，能够使科研用户在芯片上轻松获得单个克隆/细胞，对单个克隆/细胞进行在单细胞水平下进行一系列的基于如细胞形态，细胞基因组学，功能表型的丰富的研究方案，同时科研完成特异性细胞亚群的分选富集，高产细胞系的回收和放大，目标细胞的生物学的功能研究。
单细胞光导系统TARS科研广泛应用于：单细胞多组学研究，抗体发现、抗体工程研究，工程细胞株筛选，T细胞功能研究/TCR-T筛选，功能基因组学/CRISPR 筛选，肿瘤免疫治疗研究，干细胞分离分化研究，类器官拓展研究以及合成生物学等领域。
以上就是我们对单细胞多组学的应用前景和硬件需求的分享，限于篇幅原因，很多方法和应用案例无法完全展示，欢迎联系Lychix彩科生物作进一步交流。
参考文献(可向下滑动查看)：
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