威尼德生物科技(北京)有限公司,使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三种波长制造了四款紫外交联仪,主要包括VL-1000A系列紫外交联仪(365nm)、VL-1000B系列紫外交联仪(302nm)、VL-1000C系列紫外交联仪(254nm)、VL-3000系列紫外交联仪(三种波长)满足不同的科研需求。

胡孝辉,高丰厚,方勇

(上海交通大学医学院附属第三人民医院烧伤整形科上海 201900)

[ 摘要] 目的:观察中波紫外线(UVB)诱导人皮肤成纤维细胞中 β-catenin 及其下游基因 c-myc 的变化,探讨其在紫外线诱导光老化和肿瘤发生中的作用。方法:使用组织块法分离培养原代成纤维细胞,使用第 2~8 代人皮肤成纤维细胞进行紫外线处理,倒置荧光显微镜观察其形态学改变,β-gal 半乳糖苷酶细胞衰老试剂盒染色衰老细胞、western blot 检测衰老相关蛋白 P16的表达,western blot 检测紫外线处理人皮肤成纤维细胞各时相点 β-catenin、c-myc 蛋白表达水平,RT-PCR 检测紫外线处理人皮肤成纤维细胞各时像点 β-catenin、c-myc mRNA 水平的表达变化。结果:40 mJ/cm2UVB 单次照射后可以诱导人皮肤成纤维细胞衰老,β-gal 衰老染色阳性率达到约 90%,衰老相关基因 P16 蛋白表达明显升高,β-catenin、c-myc 蛋白表达水平和mRNA 水平照射后较未照射组均明显降低。结论:紫外线 UVB 处理人皮肤成纤维细胞可以诱导其发生衰老改变,衰老细胞中β-catenin、c-myc 表达水平明显降低,这些结果与皮肤黑色素细胞瘤相关基因改变的研究相近,为以后皮肤恶性肿瘤的研究提供了线索。

[ 关键词] 人皮肤成纤维细胞;光老化;beta-catenin;c-myc

紫外线照射以后可以诱导皮肤光老化,导致皮肤变得粗糙、皱纹加深[1],同时老化可以限制细胞的无限制生长抑制肿瘤的发生,临床上发现皮肤黑色素细胞瘤多发生于非日光暴露部位,是否紫外线在其中起了重要的作用,这其中的机制还不是十分清楚[2]。有学者认为[3],光老化是一种癌前状态,也有学者[4]认为细胞衰老是限制细胞发生癌变的一种保护措施。我们的研究通过紫外线照射正常人皮肤成纤维细胞诱导其光老化,并对成纤维细胞光老化过程中 beta-catenin 和c-myc 两个癌基因的变化进行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器:胎牛血清和高糖 DMED 培养基(Gbico公司),0.25%胰酶-0.02%EDTA,β-gal 半乳糖苷酶细胞衰老染色试剂盒(碧云天公司),2×SDS 蛋白裂解液(碧云天公司),兔抗人 β-catenin 抗体,兔抗人 P16 抗体、兔抗人 c-myc 抗体(cell signaling),辣根过氧化物酶标记羊抗兔 Ig二抗(cell signaling)。Takara RT-PCR 扩增试剂盒(大连生工)。VL-3000紫外交联仪、威尼德生物科技(北京)有限公司,使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三种波长制造了四款紫外交联仪,主要包括VL-1000A系列紫外交联仪(365nm)、VL-1000B系列紫外交联仪(302nm)、VL-1000C系列紫外交联仪(254nm)、VL-3000系列紫外交联仪(三种波长)满足不同的科研需求。

1.2 实验方法

1.2.1 人成纤维细胞的分离与培养:我院泌尿外科儿童包皮环切术后包皮(患者知情同意),去除皮下脂肪及血管根据文献方法[5],采用组织块法分离获得包皮成纤维细胞,高糖 DMEM 培养基加 10%胎牛血清培养,细胞长至 90%融合后 0.25%胰酶-

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0.02%EDTA 消化传代扩增。取第 2~8 代细胞进行实验。1.2.2 人成纤维细胞紫外线诱导光老化:取 2~8 代人成纤维细胞使用紫外交联仪在 312nm 中波紫外线(UVB)下照设,UVB

能量在 20~40mJ/cm2范围内照设后 48h 按 700 个细胞 /cm2 重新接种于六孔板中,24h 候后 β-gal 半乳糖苷酶细胞衰老染色试剂盒检测细胞衰老情况。1.2.3 蛋白印迹检测衰老人成纤维细胞中 P16、β-catenin、c-myc 蛋白表达变化:取 2~8 代人成纤维细胞按 1×106个每皿接种于直径 100mm 培养皿中,接种后 24h 细胞长至 80%融合,在 40 mJ/cm2UVB 紫外线下照射,于照射后第 0、12、24、48、72h 收集细胞,2×SDS 蛋白裂解液裂解细胞收集蛋白,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳,一抗(β-catenin 1:1000,c-myc1:200,P16 1:1000)4℃ 结合过夜,TBS 洗涤 3 遍,每遍10min,加入二抗(1:2000),室温孵育 2h,ECL 试剂盒显色,图像分析仪扫描成像,以 GAPDH 为内参进行半定量分析。1.2.4 RT-PCR 检测衰老人成纤维细胞中 β-catenin、c-mycm RNA 表达变化:取 2~8 代人成纤维细胞按 1×106个每皿接种于直径 100mm 培养皿中,接种后 24h 细胞长至 80%融合,在40mJ/cm2UVB 紫外线下照射,于照射后第 0、12、24、48、72h 采用 Trizol 法提取细胞总 RNA 根据 Genbank 中 β-catenin、c-myc 和 GAPDH 的 cDNA 序列设计如下引物(上海生工公司合成)。Β-catenin (120bp)引物:5'-TGG ACT CTG GAA TCCATT CTG-3' (F), 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'(R), c-myc (313bp) 引物:5'-TGG ACT CTG GAA TCC ATTCTG-3' (F), 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'(R),GAPDH(289bp)引物:5'-TGG ACT CTG GAA TCC ATT CTG-3'F), 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'(R)。以 GAPDH 为内参,图像分析仪扫描成像,ImageQuant 软件半定量分析。

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2 实验结果

2.1 人皮肤成纤维细胞的分离与培养:采用组织块法培养第 4 天开始有细胞从组织块边缘爬出,第 10~14 天细胞长至融合,长梭形细胞中间可见铺路石样细胞表皮细胞,将融合细胞按 1:3 进行传代,传代后细胞生长加速第 2 天可融合,从第 2 代开始细胞呈典型的长梭形,铺路石样表皮细胞消失。2.2 UVB 诱导成纤维细胞衰老及 β-gal 半乳糖苷酶细胞衰。

老染色:UVB20~40mJ/cm2能量照射后可见细胞生长停滞呈典型衰老形态,细胞形态上变得宽大扁平,胞浆透明,胞核内颗粒增多,(图 1①~②)。β-gal 半乳糖苷酶细胞衰老染色

可见典型衰老细胞核周染成蓝色, 对照组细胞阳性率为(18.23±3.24)%,诱导衰老组阳性率为(88.75±5.32)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图 1③。2.3 诱导衰老细胞中 P16 蛋白的表达:UVB 诱导衰老后第12h 开始衰老相关基因 P16 表达增加,随时间延长表达量也增加,至照射后 24h 开始 P16 表达明显高于照组前细胞(见图 2)。2.4 UVB 诱导人皮肤成纤维细胞衰老后 β-catenin、c-myc蛋白水平变化:UVB40mJ/cm2 照射人皮肤成纤维细胞后从第12h 开始 β-catenin、c-myc 蛋白表达水平分别开始降低,至照射后第 72h 这两种蛋白的表达水平降至最低(见图 3)。2.5 UVB 诱导人皮肤成纤维细胞衰老后 β-catenin、c-mycmRNA 水平变化:UVB40mJ/cm2 照射人皮肤成纤维细胞后β-catenin、c-myc mRNA 表达水平分别从照射后第 48、24h开始降低,至照射后第 72h 降至最低(见图 4)。威尼德生物科技(北京)有限公司,使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三种波长制造了四款紫外交联仪,主要包括VL-1000A系列紫外交联仪(365nm)、VL-1000B系列紫外交联仪(302nm)、VL-1000C系列紫外交联仪(254nm)、VL-3000系列紫外交联仪(三种波长)满足不同的科研需求。

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3 讨论

β-catenin 基因位于 3p21, 全长 40 992 bp, 人类的β-catenin 基因产物是一个相对分子质量为 88 000 的蛋白质,呈高度进化保守性,大约保留了果蝇 80%的同源蛋白,与鼠的 β-catenin 几乎完全同源[6]。β-catenin 是 Wnt 通路的核心信号分子,以往研究表明[7]β-catenin 基因在肿瘤的发生发展中起着关键的作用。最近研究报道[8]在人皮肤黑色素细胞瘤中 β-catenin 高表达并可以抑制衰老相关基因P16 的表达,使肿瘤细胞不发生衰老保持永生化状态,β-catenin 上调其下游基因 c-myc、cyclinD1 的表达启动肿中国美容医学中国美容医学2010 年 5 月第 19 卷第 5 期 Chinese Journal of Aesthetic Medicine.May.2010.Vol.19.No.5基础研究瘤的发生。而在 β-catenin 基因敲除小鼠黑色素细胞瘤中P16 表达呈剂量依赖性增加[9]。在临床上黑色素细胞瘤多发生于紫外线所照不到的地方,且在紫外线照不到的部位β-catenin 基因高表达,这说明 β-catenin 基因的表达和降解与紫外线照射之间存在着一定的关系。研究报道[10]Braf 诱导的衰老在哺乳动物中是限制癌前病变的生理机制, 由于紫外线照射以后 Braf 基因的突变刺激 P16 的过度表达,细胞随后进入衰老状态,而在日光保护部位 Braf 基因突变减少,P16 的过度表达也不能被很好的诱导[11]。在非日光暴露部位 β-catenin 基因抑制 P16 的表达,使衰老延迟,但同时也增加了其发生肿瘤的机会.而日光暴露部位因为 βcatenin 基因表达减少, 导致 P16 高表达,使衰老提前发生。我们的研究证实通过紫外线照射以后成纤维细胞形态变的宽大扁平,胞浆透明,胞核颗粒增多,呈现典型的衰老表现,衰老相关基因 P16 蛋白表达也增高,而β-catenin 基因和其下游基因 c-myc 在蛋白水平和 m RNA水平表达均明显降低,且随着衰老时间的延长其表达水平降低越明显,这样就显著降低了其发生肿瘤的可能性。

在我们的研究中对紫外线诱导人皮肤成纤维细胞衰老的机制进行的初步研究,并发现 β-catenin、c-myc 基因在紫外线照射以后呈时间依赖性减少,为以后光疗治疗肿瘤提供了依据。但对紫外线照射通过何种途径诱导 β-catenin及其下游基因 c-myc 减少则没有进行进一步的研究;而且临床上体表皮肤肿瘤多发生于老年人这和我们的研究结果存在矛盾,这其中的机制还需要进一步研究。