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全球肆虐的新冠疫情促使美国FDA于2021年8月23日和2022年1月31日完全批准了两款新冠疫苗,分别是辉瑞/BioNTech合作开发的Comirnaty(BNT162b2)与Moderna公司开发的Spikevax(mRNA-1273)。这2款疫苗都是mRNA疫苗。

新冠病毒序列于2020年1月11日公布,数周之后的3月16日,mRNA-1273就完成首例受试者 接种 。可以说,这两款疫苗的快速获批,离不开研究人员数十年如一日地深耕传染病与肿瘤领域的mRNA疫苗研究。

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2020年,新冠mRNA疫苗赛道研究火热(来源:Nature Biotechnology)

1990年,Wolff等人首次发现,mRNA可以在体内翻译出蛋白质,从而证明了mRNA可用于疫苗接种。而几十年后的今天,这项技术才真正在临床获得验证。这其中的原因部分来自于2000年左右mRNA的稳定性与递送方面出现技术困难,行业研发重点和资金流向暂时转向DNA疫苗技术。

然而,mRNA设计与制造的简便性、固有的 免疫 原性 、快速量产性以及微不足道的插入突变性仍然深深地吸引着一些研究人员,他们继续从事着mRNA疫苗的研究。

mRNA技术的一项格外重要的优势在于mRNA可以作为蛋白翻译的模板。传统的疫苗工艺依赖于生物反应装置或鸡蛋中使用哺乳动物细胞批量生产疫苗,而mRNA疫苗只需在接种者体内经过一次转化就可以发挥作用。实际上,mRNA正是利用人体作为“生物反应装置”,这一过程天生具有以下几项优势:

首先,mRNA允许人体对编码蛋白进行翻译后修饰(PTM),这种蛋白免疫原性低、可完全发挥作用。其次,在生物反应器中不能产生的多聚体蛋白可以在接种者细胞内完成正确的翻译、折叠和组装。例如,Moderna公司巨细胞病毒(CMV)mRNA-1647疫苗是5种mRNA的混合物,体内可产生五聚体蛋白。此外,mRNA疗法可以产生跨膜蛋白和细胞内蛋白,并可在细胞中将这些蛋白转运到适当的位置发挥作用。

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mRNA-1647组成(来源:Moderna公司官方Facebook)

在病毒载体疫苗中,若患者之前接触过这种病毒,体内可能存在针对这种病毒的抗体;而接种过这种疫苗后,体内也会产生相应抗体,不利于后续加强针的疗效。因此,这类疫苗的适用人群有限。而mRNA疫苗出现这种现象的可能性较小。

与其他药物类型一致,mRNA的剂量与给药间隔需要按照接种者的实际情况(体重、健康状况等)做出调整。此外,由于疫苗的作用时间有限,不可逆副作用的可能性较小,仅需针对接种后的急性症状加以治疗。由于mRNA降解受正常细胞功能调控,mRNA的体内半衰期可以通过分子修饰与递送方法调节。

mRNA药物可分为3类,即预防性疫苗、治疗性疫苗以及治疗性药物(protein-encoding therapies),其开发过程均需要解决将mRNA递送至靶细胞,同时维持mRNA的结构稳定性的难题。

RNA分子本身不稳定。目前,提高mRNA稳定性的技术包括优化5’帽子结构 (5’Cap)、调整3’Poly(A)尾长度以及修饰5’和3’非翻译区中的调控元件。

除了优化mRNA体内稳定性之外,还需要有效的细胞递送。十多年的研究发现,以脂质纳米粒(LNP)递送mRNA可以有效解决这一问题。LNP中,磷脂(如二硬脂酰磷脂酰胆碱,DSPC)组成类似细胞膜的脂质双分子层,其中插入的胆固醇可以调节脂质双分子层的流动性。聚乙二醇(PEG)可提高胶体稳定性,并减少调理作用(抗体、补体与吞噬细胞表面结合,促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用)。胶束内部为阴性RNA,可与脂质双分子层中的离子型或阳离子LNP电荷相互作用,提高稳定性。

聚合物纳米粒子(polymeric nanoparticles,PNPs)是另一类具有潜力的递送载体。PNPs可以与磷脂、胆固醇和PEG组装,实现不同的理化性质。LNPs和PNPs都可以进一步以特异性的配体修饰,提高细胞靶向能力。

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mRNA递送系统的结构组成(来源:Nature Biotechnology)

当mRNA作为疫苗使用时,需要适当的免疫原性激活人体免疫系统;而利用mRNA翻译出特定蛋白发挥治疗作用时,则希望避免免疫原性。这是mRNA药物的生产与处方开发中需要重点考虑的因素。作为RNA病毒遗传物质或DNA病毒复制副产物的RNA可以对固有免疫系统产生强烈的刺激。微生物RNA有许多结构和序列特征,人体免疫系统可以将微生物RNA与宿主RNA区分开来。机体2种模式识别受体(PRRs)可识别病原微生物的某些保守组分,即病原相关分子模式(PAMPs),通过激活受体特异性的信号转导通路,诱导促炎症因子和I型干扰素(IFN-1)的表达,产生非特异性抗病原微生物反应。

第一种PRR为Toll样受体(TLR)系统,位于上皮细胞和免疫细胞(如DC细胞、单核细胞与巨噬细胞)的细胞膜、内涵体与溶酶体上。第二种为维甲酸诱导基因I(RIG-I)样受体,位于绝大多数细胞的细胞质中。TLR3被双链RNA(dsRNA)激活,而TLR7和TLR8由单链RNA激活。RIG-I和黑色素瘤分化相关蛋白5(MDA5)在细胞质中分别被短(18-19bp)和长的(>1000 bp)的dsRNA激活。TLR3激活将通过包含TIR结构域的接头蛋白1(TICAM-1)信号通路产生IFN-1,而其他TLRs利用髓样分化蛋白MyD88依赖的级联反应介导核因子κB(NFκB)依赖的或干扰素调节因子(IRF)3依赖的方式产生促炎细胞因子。需要根据临床应用考虑上述信号通路被mRNA药物及其递送载体激活的程度。

预防性mRNA疫苗

Comirnaty与Spikevax获FDA批准意味着传染病防治的划时代的进步。然而,该领域还需要除了新冠以外的疾病验证。

mRNA分子固有的免疫刺激性使其可同时作为免疫佐剂,提高人体免疫水平。然而,产品开发过程中需要平衡免疫刺激性与编码抗原表达的关系。Oliwia Andries等人发现用N1-甲基假尿苷替代尿苷可以降低mRNA的免疫原性,且更能增强mRNA的蛋白表达能力。目前两款获批的新冠mRNA疫苗都采用N1-甲基假尿苷修饰,而未经修饰的CureVac新冠疫苗(CVnCOV)的新冠保护率仅为47%,试验结果不尽人意。

针对这一现象,CureVac认为,在CVnCOV临床试验过程中新冠病毒发生变异,与BNT162b2和mRNA-1273的试验环境并不一致;也有人认为,未经修饰的RNA免疫反应性更强,CureVac选择了更低的使用剂量(12 μg)(BNT162b2和mRNA-1273的使用剂量分别为30 μg与100 μg),但是这一剂量可能不足以产生有效的中和抗体反应。其他观点则指出,未经修饰的RNA翻译效率可能较低。

上述疫苗都是非复制型的mRNA疫苗。目前有几个基于RNA聚合酶实现自我扩增型的mRNA疫苗,可以提高抗原蛋白的表达量。相关疫苗均处于早期临床试验阶段。相较于传统疫苗,这种疫苗体积更大,递送载体需要与其实现良好的配合。

1.提高安全性

mRNA疫苗没有减毒活疫苗"毒力返祖"或在部分个体中诱发严重疾病的可能[80%的婴幼儿接种呼吸道合胞病毒(RSV)减毒活疫苗后感染RSV、引发重症并住院,同时有患儿死亡]。而与DNA疫苗或某些病毒载体疫苗相比,mRNA疫苗不会整合到接种人群DNA中引发插入突变风险。

2.缩短研发周期

新冠疫情在全球的大流行突显了能够快速应用于人体试验疫苗技术的重要性。相对于传统疫苗的开发周期,目前获批的两种新冠mRNA疫苗的开发时间缩短了11个月到几年不等。

除上述公司,其他mRNA厂商也凭借在mRNA领域积累的经验快速开发疫苗。例如,CureVac的CVnCOV于2020年6月开始I期临床研究,一年后就公布了临床II/III期试验中期结果。

严峻的公共卫生问题推动了mRNA疫苗的加速开发,促使各药企寻找缩短临床试验时间的方法(例如,将原本应该逐步递进的开发步骤同时进行、缩短前期研究时限、减少产品放行检验次数)。

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在研临床II期与III期预防性mRNA疫苗(来源:Nature Biotechnology)

3.提高规模化生产效率

由于mRNA疫苗体内发挥作用不依赖活病毒,因此无需专门的实验设备与生物安全实验室。而与鸡胚胎疫苗相比,mRNA疫苗不受鸡胚产量的限制,同时可以用于对鸡胚过敏群体的疫苗接种。在生产过程中,无需培养活的细胞,因此也不存在细菌污染的风险。

组成mRNA疫苗的基本化学成分相同,因此,建立了一条mRNA疫苗生产线后,可以对新出现的或季节性的流行病做出快速反应。例如,新的新冠毒株出现后,可以采用原有递送系统,更换编码mRNA序列即可制备针对变异新冠毒株的疫苗。

4.快速的抗原特异性序列优化

mRNA技术的另一项优势在于可以通过改变核酸序列来不断优化编码抗原,相对于制备不同蛋白或多肽的生物工程技术,这一过程相对更加简单直接。BioNTech则充分利用了这项技术的灵活性。BioNTech将至少5个不同的新冠mRNA疫苗投入临床试验(其中3种是核苷修饰的mRNA,一个使用了含有尿苷的mRNA,以及一个可以自我扩增型mRNA)。

5.编码多种蛋白和/或蛋白亚基

对新冠病毒而言,刺突蛋白是一种同源三聚体,因此只需引入单个mRNA序列。而对于免疫原由多个不同亚基组成的病原体,生产多个亚基并按照化学计量学组成,成功的完成重组并构成完整蛋白的免疫原,其中的挑战不言而喻。而mRNA可以轻松地完成上述步骤。这些独立的亚基既可以同时编码在同一个长mRNA中,也可以分散于各自独立的mRNA链中。

例如,靶向CMV的疫苗含有6种mRNA。其中,5种mRNA分别编码5种不同的蛋白质,这些蛋白完成组装后可形成一个五聚体蛋白,而第6种mRNA编码CMV的 gB糖蛋白(gB protein)。

同时,一个疫苗还可以同时靶向两种不同的病原体。例如,mRNA-1653由2种mRNA组成,可靶向人类偏肺病毒(hMPV)和副流感病毒3型(PIV3)F蛋白。

6.调节mRNA免疫原性

除了通过改变mRNA序列优化抗原免疫原性之外,mRNA本身以及在mRNA制造过程中的其他RNA产物的固有免疫都可以用于增强免疫应答。

mRNA本身的先天免疫原性可能对疫苗接种有利,因为它可以激活免疫系统。如TLR系统受mRNA激活后,可诱导DC细胞成熟,进一步产生功能强大的B细胞和T细胞免疫反应。

这种RNA驱动的免疫反应也可能有害。前面提到的CureVac的CVnCoV结构未经修饰,可能导致RNA依赖性蛋白激酶R(PKR)激活,抑制mRNA翻译。

目前,调节mRNA免疫原性主要的方法是核苷酸化学修饰。Kariko等人的研究报告指出,假尿嘧啶与5-甲基胞苷可显著降低TLR信号转导与PKR激活,从而导致小鼠体内相应蛋白水平升高。值得注意的是,辉瑞与Moderna获批的两种新冠疫苗都将尿嘧啶替换为N1-甲基假尿苷。

其他的研究则指出,与核苷酸经过修饰的mRNA相比,未经修饰的mRNA在细胞与小鼠体内可观察到更高的目的蛋白表达。有观点认为,这项研究与此前观点矛盾的原因可能是改进了mRNA纯化方法以及除去了其他RNA干扰物质。以HPLC、快速蛋白液相色谱以及亲和分析技术除去dsRNA大幅提高了翻译效率。来自CureVac的研究人员报告称,经HPLC纯化、序列优化后未经修饰的mRNA不具免疫原性,相对于化学修饰的mRNA可产生更高的蛋白水平。

最近,基因泰克的科学家报告称白介素(IL)-1β和IL-1受体激动剂是调控机体对mRNA反应的关键,因此,小鼠、非人灵长类动物和人体内调控元件的差异可能解释了这些物种体内尿嘧啶修饰与未修饰mRNA反应原性的不同。

7.递送mRNA的纳米制剂

早期mRNA的接种形式为裸露的mRNA或鱼精蛋白与mRNA紧密结合形成的纳米颗粒。例如,狂犬病疫苗CV7201是采用鱼精蛋白制备的,这种疫苗的免疫原性严重依赖于接种方式,只有一种利用无针装置的皮内注射出现了预期的免疫反应。

目前,绝大多数mRNA药物都采用LNPs递送。FDA批准的首个RNA寡核苷酸药物(patisiran,一种用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性心肌病与转甲状腺素蛋白家族性淀粉样多发性神经病的RNAi药物)即采用LNP递送。此外,BioNTech新冠疫苗BNT162b2也是采用LNP系统递送的。

脂质组成的鉴定、测试和生产对于疫苗进入临床试验的速度非常重要。由于CMV疫苗mRNA-1647和hMPV–PIV3疫苗mRNA-153已有来自临床与监管部门的经验,mRNA-1273使用了与上述二者一致的LNP。

LNP制剂的组成可显著影响胞内递送效率,决定递送靶细胞的特异性并调控免疫原性。尽管组成LNPs的各种成分功能都必不可少,离子型脂质在RNA递送的许多方面起着至关重要的作用,如微粒形成、细胞摄取与内涵体逃逸。

目前脂质开发重点关注引入水解基团促进清除,然而,这些可降解官能团将影响制剂的稳定性。将mRNA LNP冻干是提高制剂稳定性的一个策略。但是,对于mRNA药物中给药剂量较低的应用场景(如疫苗),采用抗水解的脂质可能更加合适。

除了全身给药的RNA纳米颗粒外,其他类型的RNA给药方式为其在神经系统、眼、心脏、肺部应用提供了基础。需要尤其注意的是,基于生物降解聚合物、寡聚物和脂类的纳米颗粒可使mRNA通过雾化给药作用于肺上皮组织。例如,囊性纤维化患者反复服用MRT5005,这是一种LNP递送的mRNA雾化制剂,可编码囊性纤维化跨膜调节蛋白。

8.贮藏与运输

处方组成关系到储存与运输条件。2014-2016年埃博拉疫情期间,一种减毒重组水疱性口炎病毒疫苗(2019年获批,商品名为Ervebo)必须在-80℃ ~ -60℃储存,这在非洲疫情最严重的地区难以执行。这次事件凸显了疫苗贮存的困难。

当下,新冠疫情影响全球,从全球应急准备来看,当务之急在于数以百万的新冠疫苗需要运输到全球各地,这些国家气候差异巨大,同时也包括了很多医疗保健基础较差的国家。

据报道,CureVac的CVnCoV疫苗在冰箱5°C下可保存至少3个月;室温条件下用于接种时,有效期仅为24 h。Moderna的mRNA1273在−20°C保存时限长达6个月,在冷藏条件下也可保存30天,但在室温仅可保持12 h的有效性。

首次人体试验(FIH)通常参与的受试者与研究基地数量有限。有些情况下,试验中采用的处方并不是最理想的。此时,制剂贮存稳定性的优化工作会与临床试验同步进行。例如,Moderna的CMV候选疫苗mRNA-1647临床I期受试药物为冷冻的液体制剂;而在临床II期时受试药物已经变成冻干制剂,冰箱中储存18个月内稳定。

mRNA-1443的开发过程进一步强调了必须通盘考虑mRNA药物运输、贮存与稳定性。mRNA-1443靶向CMV磷酸蛋白65 T抗原。该药物与mRNA-1647在同一临床试验中评估。然而,2018年8月,由于mRNA-1443受试药物稳定性不满足接受标准,该药物的开发从此被搁置。

以冻干粉的形式贮存和运输是mRNA药物最常使用的方法。然而,在冻干过程中由结晶和真空脱水产生的应力可能会降低生物大分子或LNPs的稳定性,导致活性丧失。有报道指出,向制剂中加入某些冷冻保护剂(如海藻糖、蔗糖和甘露醇)可以维持特定处方的稳定性。目前,辉瑞已经启动了一项III期试验,评估冻干BNT162b2制剂与冷冻液体BNT162b2制剂安全性与耐受性的差异。

9.给药方式

尽管目前获批的新冠mRNA疫苗都选择肌内注射,关于mRNA疫苗的最佳接种途径还没有达成共识。目前全球爆发的新冠疫情必然要求采用接种难度低的免疫方式,尽可能减少医疗人员的培训成本。目前,BTN162b2、CVnCoV、ARCT021和mRNA-1273都选择肌内注射;而来自伦敦帝国理工学院的研究人员则考虑通过吸入给药实现mRNA疫苗的自我扩增。吸入或鼻滴疫苗可引发细胞和体液免疫,这种方式对包括新冠病毒在内的呼吸道传染病防治中特别有效。然而,鼻腔内mRNA疫苗的研究目前仍停留在动物模型阶段,需要开发基于LNP的mRNA递送系统实现上呼吸道相关细胞的精准递送以进一步评估效果。

在mRNA领域,皮内注射和肌内注射都可用于候选疫苗的评价,有些时候在同一研究中的同一疫苗会同时评估两种给药方式,因为这两种给药方式在免疫原性与耐受性方面可产生不同的结果。例如,mRNA-1440(H10N8流感病毒疫苗)临床I期试验中在健康受试者体内分别评估了肌内注射(25–400 µg)和皮内注射(25–50 µg)。相较于肌内接种,皮内接种引起了更多的不良反应。皮内注射mRNA-1440 25 μg已经显示出较肌内注射更强的免疫原性。但是3例肌内接种400 μg剂量mRNA-1440的受试者中,2例出现了严重的头痛与红斑等严重不良反应,因此安全委员会停止了这种给药方式进一步的剂量爬坡试验。

总的来说,肌内接种仍是各种疾病mRNA疫苗最常用的给药方式。

10.给药方案

对于新冠疫情的全球防治而言,最理想的给药方案是单次给药,即接种后可立即实现100%的血清转化,但当下还没有达到这种程度。目前采取的策略是加强免疫,即间隔数周内接受至少2次注射。例如,BNT162b2的接种方式为21天肌内接种2次;CvnCOv和mRNA-1273则在初始注射4周后进行加强免疫。

然而,由于早期疫苗短缺,以及单次注射后观察到的部分保护现象,一些人开始主张向更大人群单次免疫接种,而不是向接种人群接种加强针;或者将接种间隔延长得比在临床试验中的更长。一项针对80岁以上成年人的小型临床试验结果表明,间隔3个月(而不是规定的3周)接种2针BNT162b2可提高抗体浓度峰值。

自我扩增型mRNA疫苗(如ARC-021和BNT162c2)则有望实现单针接种。例如,RSV疫苗mRNA-1345的I期临床试验采用在2个月内接种3次的给药策略,而III期临床中将考察单次接种结果。

尽管技术和抗原选择上具有相似之处,在研新冠疫苗覆盖了非常宽的剂量范围。自我扩增型新冠mRNA疫苗每剂用量较小。例如,帝国理工学院自扩增新冠mRNA疫苗临床试验剂量在0.1~1 μg之间;ARCT-021单次注射剂量为1~10 μg,同时需要注射加强针。BNT162b2和mRNA-1273分别在30 μg和100 μg下成功预防了95%新冠感染。而CVnCOV正在进行剂量为12 μg的III期临床试验。

11. mRNA作为佐剂使用

如上所述,RNA本身即具有免疫激活功能。作为RNA固有免疫原性的补充或者替代,有些研究团队已经在疫苗中添加了某些刺激分子,增强机体对编码抗原的免疫反应,这种方法已经有部分成功案例。

CureVac公司的CV8102产品中使用了一种非编码无帽单链RNA与阳离子肽载体复合物增强狂犬疫苗的免疫原性。CureVac公司的RNActive疫苗技术平台来源于已经停产CV7201疫苗。该平台依赖于一种双组分mRNA疫苗,其中裸露的mRNA用于抗原表达,而与鱼精蛋白组成复合物的同一种mRNA是激活TLR7和TLR8信号通路的佐剂。TLR信号刺激信号可以导致固有免疫的DC细胞对鱼精蛋白响应激活。

然而,在mRNA疫苗中佐剂用处不大。BNT162b2和mRNA-1273仅需要mRNA-LNP制剂,而不需使用佐剂;目前,绝大多数临床试验阶段的mRNA疫苗都遵循没有佐剂的原则。这可能是由于LNP组成本身就可以刺激免疫系统的特定通路,如干扰素基因刺激蛋白(STING)信号通路以及固有免疫的TLR-维甲酸诱导基因I样受体(RLR)非依赖性介体。

纳米制剂既能将mRNA递送至特定的细胞靶标,又能通过合理的设计实现免疫系统特异性激活,这是mRNA用于疫苗的优势。

12. mRNA疫苗的副作用

由于疫苗本身预防性、非治疗性的特性,对传染病疫苗需要较高的安全性与耐受性标准。疫苗局部注射疼痛、局部或全身炎症(发热、不适)是接种疫苗后最常见的不良反应。

两款新冠mRNA疫苗已在超过300 000例健康受试者(含老年人群)中接种,可以很好地用于评估疫苗的不良反应。需要强调的是,BNT162b2(30 μg)和mRNA-1272(100 μg)之间除了存在约3倍的剂量差异之外,还需要考虑由此产生的mRNA和脂质注射的差异。临床试验中,可以用纳入/排除标准剔除某些高风险人群(如有既往过敏史患者),因此数据不能完全代表需要保护人群的结果。

在BNT162b2和mRNA-1273的III期临床试验中,超过80%的疫苗接种者报告出现了局部不良反应,主要是疼痛。全身不良反应主要是头痛、疲劳、发烧、肌痛和关节痛。对mRNA-1273,在加强针后出现不良反应的频率和严重程度会更明显。由于在III期临床中的安慰剂是生理盐水(而不是裸露的mRNA或空白LNP),目前尚不确定是mRNA和LNP中的哪一种引发了这些不良反应。

特别备注:本文摘编自Nature Biotechnology 5月9日发表的题为“The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies”的综述,因原文篇幅过长,本篇以预防性mRNA相关内容为主,抗肿瘤mRNA疫苗以及基于mRNA的蛋白疗法及细胞疗法相关内容将在下一篇文章发布。

参考资料:

[1]Ann J. Barbier et al. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 2022.

[2]https://hi-in.facebook.com/modernatx/photos/modernas-congenital-cmv-mrna-vaccine-includes-6-mrnas-in-one-vial-5-encode-the-p/2578454152220179/

[3]Oliwia Andries et al. N1-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice. Journal of Controlled Release. 2015.