2022年5月19日，Nature Communications (IF：14.92)在线发表了题为Multiplex base- and prime-editing with drive-and-process CRISPR arrays的研究论文，该论文由莱斯大学高雪团队完成。作者利用tRNA驱动DAP阵列(drive-and-process array)的策略开发出MBE(multiplex base-editing)和MPE(multiplex prime-editing)编辑器，可以在哺乳动物细胞中最高实现31个基因位点同时碱基编辑和最高3个基因位点同时向导编辑，为生物医学研究以及基因疾病的治疗提供了工具与思路。
CRISPR/Cas9不能自成熟gRNA以及构建多基因编辑载体时会导致载体容量过大，降低递送效率，所以限制了其在利用AAV递送时的应用。Cas12a可以自成熟gRNA，但是现在Cas12a缺乏类似nCas9一样的缺刻酶变体以用于提高编辑效率，并且Cas12a还没有在PE系统中应用。基于此，作者首先利用Cas12a的变体dLbCas12a测试了5位点多基因编辑的效率，ABE-dLbCas12a最高可实现18.1%的编辑，平均编辑效率为2.3%；CBE-dLbCas12a最高可以实现15.4%的编辑，平均编辑效率5.4%。
随后作者利用nCas9和tRNA-gRNA相结合的编辑器探索了MBE的编辑效率，tRNA-gRNA可以在内源的RNase P和RNase Z作用下分离得到gRNA。来源于人的hCtRNA (75bp)结合5’端的2-20nt的引导序列(图1-b)最高可以实现60%的多位点编辑效率(图1 b-d)。为了进一步紧凑载体构建，她们直接利用hCtRNA代替启动子(图1-a)，发现仅用hCtRNA启动gRNA的编辑效率和利用hU6作为启动子时，编辑效率类似或略有提高(图1-e)，同其他类型的启动子对比后得出了相同的结论(图1 f-g)。随后她们靶向5个位点，对比了基于nCas9的hCtRNA-MBE和dCas12a-MBE，发现ABE8e-nSpCas9最高可以实现74%的编辑效率，NBE4-max-nSpCas9最高可以实现71%的编辑效率，是dCas12a-MBE实现效率的15倍(图1-h)。这说明她们建立了一个强大的基于nCas9的MBE策略，通过使用DAP阵列而不需要任何额外的启动子来实现人类细胞中高效的MBE。
图1 为MBE开发DAP策略
利用hCtRNA-M载体构建形式，测试了靶向10位点、16位点和20位点的多基因位点编辑效率，NBE4max介导的10位点MBE最高可以实现63.7%的平均编辑效率，ABE8e(V106W)介导的10位点MBE最高可以实现56.9%的平均编辑效率(图2 d,g)；对于20位点，ABE8e可以实现所有位点平均50.9%的编辑效率(图2 e,h)。她们利用开发的ACME(TadA-8e(V106W)−1xUGI-hA3A(Y130F))，通过将两个16个基因组的阵列(两个阵列中的一个gRNA是相同的)与ACME汇集在一起，观察到31个不同基因组位点的平均编辑率为51.3%(图3 f,i)。这些结果证明了使用DAP策略的高效和可扩展的MBE。
图2 DAP策略实现大范围的MBE
在hCtRNA-M阵列中gRNA3’末端和5’端延伸的向导序列之间加入7bp的Poly T(图3 a,c)解决了剪切之后在5’端留下的碱基残基影响pegRNA结合DNA链的问题，经过改造的hCtRNA-M，在3位点的多位点编辑中最高可以实现57.5%的编辑效率(图3 b)。
图3 DAP策略实现MPE
该论文开发的DAP策略结合BE和PE系统可以轻量化高效实现多位点编辑，MBE和MPE的应用将使复杂的生物研究和复杂的治疗方式成为可能。将DAP策略与更多新兴的基因组工程工具、CRISPR筛选方法和递送技术相结合，将继续为基础生物学、作物工程和治疗学提供有价值的工具。
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