Mol Cell 争鸣 | 不依赖于相分离,转录因子通过多价相互作用增强转录活性

2022-05-16 20:05:59 陕西 BioArt植物
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撰文 | 言笑

转录因子(transcription factors, TFs)和共激活子(coactivator)与启动子和增强子的动态结合是基因调控的核心。大多数转录因子包含一个结构上定义明确的DNA结合结构域(DNA-binding domain,DBD)和一个单独的激活结构域(activation domain,AD),该激活域通常具有内在无序区域(intrinsically disordered regions,IDRs)。通过以模块化方式组合 DBD 和 AD,已经构建了许多合成转录因子。这些转录因子使用具有特别高转录激活能力的ADs,类似于来自单纯疱疹病毒蛋白的VP16【1】和VPR(VP64-p65-Rta)【2】

TF启动子结合位点占有率和DBD动力学结合参数共同调节靶基因表达【3-4】。结合位点在足够高的TF浓度下变得完全饱和,但结合位点占有率和 TF 停留时间(residence time)都可以决定转录激活能力【5】。此外,虽然TF-DNA相互作用的动力学参数强烈依赖于DBD,但最近的研究表明,染色质处的TF组装不仅限于直接DBD-DNA相互作用。在 SP1、TAF15和OCT4等转录因子的ADs,MED1/19、p300 和 BRD4 等转录共激活因子,以及 RNA Pol II 的非结构化 CTD中发现的 IDRs 都可以在增强子和启动子处驱动相分离转录凝聚物(transcriptional condensates)的形成【6-7】。这一过程常用的机制是液-液相分离(liquid-liquid phase separation,LLPS)。在大于临界或饱和浓度(Ccrit)时,具有IDRs的蛋白质和RNA的多价相互作用驱动相分离液体样液滴的形成,这些液滴将其构成组分与周围核质隔离开来。这种类型的TF组装可以通过不同的机制增强转录,包括:(1)增加启动子处局部 TF 浓度;(2)介导共激活剂和/或其他Pol II复合物的招募;(3)加速TF目标搜索。然而,目前的研究缺乏将液滴状态的 TF 与结合染色质但没有液滴形成的相同 TF 进行比较,无法证实转录凝析物对基因激活的直接调控作用。

2022年5月9日,来自德国癌症研究中心(DKFZ)的Karsten Rippe团队在Molecular Cell杂志在线发表了题为Transcription activation is enhanced by multivalent interactions independent of phase separation的文章。研究人员通过比较结合位点占用率、停留时间和共激活因子招募与TF多价相互作用的关系,证实相分离与TF ADs的活化强度相关,但液样TF液滴的实际形成对转录激活具有中性或抑制作用。该研究认为,ADs介导的多价相互作用以不依赖相分离的方式增强TF的转录激活能力:(1)增加TF在染色质结合状态下的停留时间;(2)促进共激活因子招募。

该研究中,作者主要通过4种功能分析来探究转录因子的特性(图1):(1)利用基于PHR/CIBN结构域的光诱导系统(可实现快速且可逆的 TF 积累)评估相分离TF液滴形成的作用;(2)通过tdMCP与MS2 RNA结合追踪新生RNA合成的动力学,同时通过qRT-PCR对新生RNA进行定量分析;(3)通过报告因子(tetO/lacO)结合位点聚集的荧光TF的FRAP来测量TF的驻留时间;(4)通过显微镜检测TF触发的转录激活标识H3K27ac和BRD4的富集情况。

图1. 分析转录因子活性的4种方法

首先,作者使用光诱导TF系统探究了VP16、p65、Rta、STAT2和VPR这5个ADs发生相分离的能力。结果显示,Rta、p65 和 VPR 很容易组装成液滴,而 VP16 和 STAT2 很少或不存在。作者通过临界浓度(Ccrit)描述了ADs 驱动相分离的倾向:Rta、p65 和 VPR(Ccrit=0.19)具有较高LLPS倾向,而STAT2(Ccrit>1.5)和VP16(Ccrit=0.54) LLPS倾向较低,表明这5个AD的相分离能力从STAT2、VP16、Rta、p65到VPR依次增强。随后,作者通过tetO/lacO报告系统检测了这5个ADs的转录激活能力,发现具有较高相分离倾向的 ADs 如 p65、Rta 和 VPR 比 VP16 和 STAT2的活性更强,表明AD的转录激活能力与其相分离能力呈正相关。那么相分离是否真的增强了转录激活?通过比较相同AD在发生相分离和未发生相分离的细胞中的转录激活能力,作者发现,这两种细胞中的新生RNA并无明显差异。发生相分离的细胞中,RNA生成能力反而有一定的减弱,说明转录过程的激活并不需要相分离的发生,相反,某些类型的液滴(例如含有桥接因子的液滴)还可能对转录有抑制作用。

TF停留时间可以决定转录激活能力,它主要受到稳定多价相互作用的影响,而与相分离过程增加的TF局部富集无关。作者对包含具有高(VPR)或低(VP16)参与多价相互作用倾向的 AD 的 TF 结构进行了 FRAP 分析,发现TF 驻留时间不仅取决于 DBD,而且受到AD属性的显著影响。VPR促进了其他 AD分子与那些已经与 DNA 结合的分子的间接结合,并在相互作用较弱的情况下稳定了直接结合的蛋白质。说明TF驻留时间由DBD和AD共同决定。通过进一步分析,作者证实了驻留时间的变化确实影响了激活能力,而与结合位点的占用无关,缩短驻留时间,可以显著降低激活能力。

TFs 通过不同的机制启动转录,包括转录机器的组装、开放的复合物形成和建立许可的染色质状态。为了揭示这些方面如何与多价相互作用和TF驻留时间相关联,作者对TF活性与BRD4和H3K27ac富集之间的关系进行了分析。结果显示:(1)强激活因子,如dCas9-VPR和rTetR-VPR可以诱导BRD4和H3K27ac的转录和强富集;(2)以rTetR-VP16为代表的激活剂,在非常低的BRD4和H3K27ac水平下显示出中等但稳健的激活;(3)dCas9-opto/optoloop构建体有效地招募了BRD4并诱导了乙酰化,但未能激活转录。这些数据表明,转录激活可以独立于 BRD4 和 H3K27ac 进行。同时,作者观察到,VPR的激活会伴随BRD4的累积,而在VP16中没有观察到类似现象。因此,作者推测 VPR 和 BRD4 之间的瞬时多价相互作用可能有助于更快和更强的激活。与预期一致,BRD4 积累伴随着转录激活,但不是必需的,它可能通过VPR增强激活或稳定激活状态。那么组蛋白乙酰化是否有助于增强VPR的活化能力?作者发现,与 VPR 相比,VP16 的预先存在的组蛋白乙酰化可以更强烈地增加诱导转录,说明VPR较少依赖预先存在的组蛋白乙酰化。

总的来说,作者通过比较一组 TFs 结构,剖析了 DBD、AD多价相互作用、相分离、共激活因子招募和组蛋白乙酰化对转录激活的贡献(图2):(1)短驻留时间导致低转录活性;(2)AD多价相互作用通过稳定结合和部分通过辅助因子相互作用增加转录激活能力;AD建立多价相互作用的能力表现在它形成相分离液滴的倾向;LLPS增加了局部TF浓度,但没有进一步增强转录(图2. TF liquid droplet);尽管启动子处有很强的TF富集,但桥接因子诱导的TF液滴可以抑制转录(图2. TF droplet with bridging factor)。该文章依旧还存在一定的局限性,例如研究中所用的都是合成的TFs、BDB和ADs,并没有内源转录因子以及真正的细胞核内的转录因子结合位点的相关实验数据,因此可能存在一定的偏差,还需要进一步地更为深入的研究。

图2. 转录激活对 TF 停留时间、多价相互作用和相分离的依赖性总结。

参考文献

1. Sadowski, I., Ma, J., Triezenberg, S., and Ptashne, M. (1988). GAL4-VP16 is an unusually potent transcriptional activator.Nature335, 563-564.

2. Chavez, A., Scheiman, J., Vora, S., et al. (2015). Highly efficient Cas9- mediated transcriptional programming.Nat. Methods12, 326-328.

3. Lu, F., and Lionnet, T. (2021). Transcription factor dynamics.Cold Spring Harb. Perspect. Biol.13, a040949.

4. Wong, F., and Gunawardena, J. (2020). Gene regulation in and out of equilibrium.Annu. Rev. Biophys.49, 199-226

5. Gurdon, J.B., Javed, K., Vodnala, M., et al. (2020). Long-term association of a transcription factor with its chromatin binding site can stabilize gene expression and cell fate commitment.Proc. Natl. Acad. Sci. USA117, 15075-15084.

6. Cho, W.K., Spille, J.H., Hecht, M., et al. (2018). Mediator and RNA polymerase II clusters associate in transcription-dependent condensates.Science361, 412-415.

7. Hnisz, D., Shrinivas, K., Young, R.A., et al. (2017). A phase separation model for transcriptional control.Cell169, 13-23.

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.04.017

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