2022年5月13日,PNAS(IF:11.205)在线发表了题为Targeted base editing in the mitochondrial genome of Arabidopsis thaliana的研究论文,该论文由来自东京大学的Shin-ichi Arimura实验室、来自京都大学的Mizuki Takenaka实验室、来自东京工业大学的Miki Okuno实验室和Takehiko Itoh实验室合作完成。该论文通过 拟南芥 密码子优化得到基于TALE的胞嘧啶编辑器(mitoTALECD),该碱基编辑器可以实现拟南芥 线粒体 基因组C-T的编辑,最高可以实现100%的编辑效率,得到的同质突变可以稳定遗传至下一代。

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陆生植物的线粒体基因组包含了细胞能量生产和农业上重要性状的基因,但目前对线粒体基因组的基因编辑仍然是困难的。碱基编辑是修改基因和基因间区域的最佳方式之一,从而了解基因的功能,同时又不会大幅度改变基因组结构。开发出可以实现植物线粒体基因组编辑的碱基编辑器将有助于揭开植物线粒体基因组的神秘面纱,也可能成为提高作物产量的基础。

该研究是基于Mok et al[1],开发的线粒体基因组碱基编辑器(TALE+DddA),因此作者首先验证该方法的可行性,评估该编辑器的C-T突变效率以及对线粒体基因组的脱靶效应。根据分离DddA 蛋白 位置以及CD-half融合的顺序,结合RPS5A启动子,共改造得到四种载体(图1-A)靶向 atp 1基因,结果显示很多T1株系具有同质突变,可以实现C10,G3,4,7位的突变,突变的C多在TC序列背景发生,还可以在AC序列背景下实现突变,其中1397CN对应的载体更易实现C10位同质突变(图1-B/C);在后续的18个T1株系中分析突变效率,18个株系共有51个碱基发生同质突变,其中44个碱基可以实现99%以上的同质突变;为了验证在拟南芥发育的不同时期的编辑情况,分别取拟南芥分层后的11天和23天的材料(图1-D),发现在不同发育天数均可找到同质突变体;对于遗传性的分析,mitoTALECD造成的突变可以稳定遗传至下一代;对于off-target的分析,脱靶位点没有发现同质突变,检测到的脱靶突变没有发生在目标窗口的2kb范围内或与TALE结构域识别的序列相似(≥70%相同)的周围。以上结果表明mitoTALECD可以有效实现编辑框内C-T的编辑,而且一些突变是稳定的同质性,因为它们在两个不同的时间点在两片叶子上被检测到,甚至在T1代中也是如此。

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图1 载体结构及编辑结果

确认mitoTALECD在拟南芥线粒体基因组具有编辑效率之后,随后利用1397CN对应的载体,靶向编辑生长迟缓突变体otp87的1178C,检测了14株T1株系,发现7个株系可以恢复像野生型那样正常生长(图2)。这些结果表明,mitoTALECD可以恢复otp87突变体的突变,且说明了1178C是造成otp87突变体生长迟缓的原因。

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图2 mitoTALECD修复otp87突变体的线粒体atp1 RNA

为了探索该方法对了解RNA编辑中目标识别过程的有用性,作者用它在atp1中引入其他碱基变化,探明预测的OTP87[2]结合序列中哪些核苷酸对RNA编辑很重要,选择在OTP87 1178C上游的-20G、-13G和-6G靶向位点,结果表明,OTP87预测的结合序列中至少有一个碱基实际上影响了RNA编辑的效率,-7G和/或-6G是编辑1178C所需要的,而且可能是识别和结合atp1转录本所需要的。另一方面,-24C和-20G可以分别被替换成U和A,而不会破坏RNA相关的编辑活动(图4)。

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图3 atp1中预测的OTP87结合序列的突变对其RNA编辑的影响

以上结果共同表明mitoTALECD介导的单碱基替换可以用来研究线粒体SNPs。线粒体基因组中的SNPs影响表型,但与某一表型相关的SNPs却很少被发现。所以mitoTALECD的单碱基替换可以成为鉴定哪些SNPs是重要的工具。其次,mitoTALECD可用于澄清功能未知的线粒体ORF的作用,包括细胞质雄性不育的候选基因,这是杂交育种的一个有用性状。该工具将有助于澄清线粒体基因的功能,以及加速寻找线粒体基因组中对作物育种有用的SNPs。

注:

[1] S. I. Arimura et al., Targeted gene disruption of ATP synthases 6-1 and 6-2 in the mitochondrial genome of Arabidopsis thaliana by mitoTALENs. Plant J. 104, 1459–1471 (2020).

[2] OTP87是一种PPR蛋白,PPR蛋白在植物中是一类非常大的蛋白质家族,在拟南芥,水稻,玉米等植物中有400多个成员。其主要定位于植物线粒体和叶绿体中。PPR蛋白是一类RNA结合蛋白,广泛参与RNA各类代谢,包括RNA剪接,RNA编辑,RNA稳定性,翻译等。