NgAgo没科研价值?南通大学刘炎等团队使用NgAgo系统构建动物模型

2021-11-26 22:17:17 iNature前沿

钙粘蛋白在组织稳态中发挥重要作用,因为它们负责胚胎发生、组织形态发生和分化过程中的细胞-细胞粘附。

近期,南通大学刘炎及Guan Tuchen在Frontiers in Cell and Developmental Biology 在线发表题为“Cadherin-12 Regulates Neurite Outgrowth Through the PKA/Rac1/Cdc42 Pathway in Cortical Neurons”的研究论文,该研究确定了介绍了 CDH12 (编码 II 型经典钙粘蛋白)在轴突延伸中的临床意义,并提出 PKA 信号传导是负责 siCDH12 诱导细胞骨架重塑调节因子 Rac1/Cdc42 抑制的重要途径。

首先,该研究通过RNA干扰评估CDH12对神经元的影响,结果表明CDH12表达的敲低抑制了E18神经元的轴突延伸。有或没有 siCDH12 处理的神经元的转录组谱揭示了一组与 CDH12 对神经突生长的影响呈正相关的途径。该研究进一步揭示,在使用 H-89 和 8-溴-cAMP 钠盐进行测试后,CDH12 以 PKA 依赖性方式影响 Rac1/Cdc42 磷酸化。此外,该研究使用免疫荧光染色研究了发育过程中 CDH12 在大脑、脊髓和背根神经节 (DRG) 中的表达。之后,该研究探讨了 CDH12 对体内神经突生长的影响。使用 NgAgo-gDNA 系统建立了 CDH12 敲低的斑马鱼模型,并确定了 CDH12 在周围神经发生中的重要作用。总之,该研究首次报道了CDH12在体外和体内对轴突延伸的影响,并对该机制提供了初步解释。

Vulnerability是神经元轴突的显著特征之一,是与其他神经元交流的基本途径。轴突长度上任何位置的损伤都会导致其功能的沉默。已经进行了大量努力来研究调节轴突生长和再生的细胞和分子机制。大多数中枢神经系统 (CNS) 神经元的抑制环境和内在生长能力较差,导致成人再生失败和功能恢复不足。神经元再生能力有限一直是该领域的研究重点。神经元的再生能力因发育阶段、器官和物种而异。之前的研究中建立了一个体外模型,该模型显示出根据发育阶段不同的轴突延伸能力,以检索导致再生能力差异的关键分子。还进行了 RNA-Seq 分析,收集了发育过程中表达持续下降的基因。

由于钙依赖性膜蛋白参与细胞间粘附和识别,钙粘蛋白构成了一个大的超家族,在人类中有 100 多个成员。它们可以根据序列相似性分为几个亚家族,例如经典钙粘蛋白(I 型和 II 型)和原钙粘蛋白(聚集和非聚集)等。钙粘蛋白在发育过程中的细胞分选和组织形成中发挥着重要作用。同样,钙粘蛋白在神经嵴形成、脊髓神经发生和大脑发育的多个阶段中发挥着重要作用。

必须协调神经发生、迁移、轴突引导和突触形成等过程,以确保正确连接神经回路。细胞粘附分子的钙粘蛋白超家族与大多数这些事件有关。钙粘蛋白还通过捕获来自细胞外空间或相邻细胞的信号来充当信号分子的受体。它们还参与调节细胞增殖、凋亡和分化。CDH12(也称为脑钙粘蛋白)是最早在大脑中发现的神经钙粘蛋白的一种亚型。后来发现CDH12在多种细胞中普遍表达。研究证实,CDH12对于多种癌症的进展至关重要,例如唾液腺样囊性癌、结直肠癌和非小细胞肺癌。此外,CDH12 与一些神经精神疾病有关。然而,CDH12 在神经突生长中的作用仍然知之甚少。

2016年5月3日,韩春雨团队在Nature Biotechnology 在线发表题为“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的研究论文,该研究发现Natronobacterium gregoryi Argonaute(NgAgo)是一种DNA引导的核酸内切酶,适用于人类细胞的基因组编辑,这一下子使NgAgo火遍全球,广大研究人员去验证其效果,很不幸,没有相关的团队能确定NgAgo有基因编辑的功能。随后引发广泛质疑,2017年8月3日,韩春雨撤回该论文。不过,其他团队有另外的发现,南通大学刘东团队在Cell Research 发表题为“NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”的研究论文,该研究发现gDNA / NgAgo可以与靶基因结合以阻断其转录,同时该研究也没有发现NgAgo具有基因编辑的能力。

在该研究中介绍了 CDH12 在轴突延伸中的临床意义,并提出 PKA 信号传导是负责 siCDH12 诱导细胞骨架重塑调节因子 Rac1/Cdc42 抑制的重要途径。此外,还研究了 CDH12 在神经系统中的表达和定位。此外,该研究在斑马鱼中进行了 NgAgo(一种来自 Natronobacterium gregoryi 的新 Ago 蛋白)介导的 CDH12 敲低,以进行体内功能验证。

使用 NgAgo-gDNA 系统建立了 CDH12 敲低的斑马鱼模型(图源自Frontiers in Cell and Developmental Biology )

首先,该研究通过RNA干扰评估CDH12对神经元的影响,结果表明CDH12表达的敲低抑制了E18神经元的轴突延伸。有或没有 siCDH12 处理的神经元的转录组谱揭示了一组与 CDH12 对神经突生长的影响呈正相关的途径。该研究进一步揭示,在使用 H-89 和 8-溴-cAMP 钠盐进行测试后,CDH12 以 PKA 依赖性方式影响 Rac1/Cdc42 磷酸化。此外,该研究使用免疫荧光染色研究了发育过程中 CDH12 在大脑、脊髓和背根神经节 (DRG) 中的表达。

之后,该研究探讨了 CDH12 对体内神经突生长的影响。使用 NgAgo-gDNA 系统建立了 CDH12 敲低的斑马鱼模型,并确定了 CDH12 在周围神经发生中的重要作用。总之,该研究首次报道了CDH12在体外和体内对轴突延伸的影响,并对该机制提供了初步解释。

参考消息:

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.768970/full

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