30分钟就可以出报告!中科大团队首创基于功能化纳米磁珠的SARS-CoV-2抗原快速检测

2021-10-23 10:28:13 生物探索

新冠肺炎的症状主要是急性呼吸窘迫综合征,呼吸道感染,最终导致不同程度的多器官衰竭甚至死亡。因此,迫切需要发展快速、准确、灵敏的检测方法,以迅速识别感染者,这不仅可以防止感染的广泛传播,还可以为患者提供更宝贵的治疗时间。现有的SARS-COV-2检测方法包括核酸检测、抗体检测和抗原试验。然而,核酸检测复杂且昂贵,需要专业人员用时2小时以上出具检测结果。抗体则是在人体接触病毒7-15天后产生的,因此抗体检测不适用于早期筛查和诊断。

来自中国科技大学的金腾川教授团队针对第三种检测方法“抗原检测”展开了研究,相关研究结果发表在《Analytical Chemistry》上,标题为:Label-Free Immunoassayfor Sensitive and Rapid Detection of the SARS-CoV‑2 Antigen Based on Functionalized Magnetic Nanobeads withChemiluminescence and Immunoactivity,针对冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白(N蛋白)的无标记抗原检测方法。这种新方法对新冠病毒表面的N蛋白的检测浓度范围:0.1 pg / mL - 10ng / mL,检测限是69 fg /mL,远远低于现有的检测方法。此外,这种检测方法只需要20-30 分钟就可以出结果并且适用于无症状感染者的早期筛查

抗原检测具有准确、对设备和人员要求低的优点。SARS-CoV-2的结构蛋白包括穗蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)、包膜蛋白(E)和膜蛋白(M)。其中,N蛋白不仅在SARS-CoV-2的 RNA的合成和翻译步骤中起重要作用,而且在血清中浓度较高,因此N蛋白适合作为新冠病毒早期检测的靶蛋白

在这项研究中,金腾川教授和团队成功合成了一种简单的化学发光功能化磁性材料(MAA/Co2+)。检测原理简单来说:在氨基磁珠上原位还原生成金纳米颗粒,再通过静电吸附和耦合配位修饰钴离子(Co2+),就得到了MAA/Co2+。MAA/Co2+通过Au-N键、Au-S键、静电吸附把N蛋白抗体连接其上,再用牛血清白蛋白(BSA)封闭未反应的部位,这样就得到了可以直接检测N蛋白的探针。这种探针具有化学发光的能力和磁性,当N蛋白与探针上的抗体结合时,使其化学发光淬灭,信号减弱。如果样品中没有N蛋白,则信号没有明显变化。

N蛋白检测探针的实验原理示意图

研究者们对实验得到的材料一一表征,验证实验设计的合理性。电镜和元素映射分析图直接表现了颗粒的元素分布和形态结构,表征了Au元素、Co元素在磁珠的分布情况,进一步证明了金纳米颗粒和Co2+离子均匀分布在氨基化磁珠的表面,证明了MAA/Co2+的成功制备。

各个阶段材料的电镜和粒径分布表征。(A)氨基化磁珠MB-NH2(B)修饰上金纳米颗粒MMA和(C)修饰了Co2+的MAA/Co2+。(D-H)单元素映射分析图。(I)MB-NH2和(J)金纳米颗粒AuNPs的尺寸分布的直方图。

MAA/Co2+的磁性试验和化学发光表征

在磁性方面的表征,随着磁场逐渐增强,MAA/Co2+的饱和磁化强度为55.98 emu/g,并且在外加磁场下是可以完全分离的(a-b)。结果表明,成功制备了CL功能化的磁性材料MAA/Co2+。在化学发光方面, MAA/Co2+的化学发光(CL)活性明显优于单独的MAA和MMA外加Co2+。MAA/Co2+中加入N蛋白抗体后,表面电位逐渐降低,这说明N蛋白抗体和BSA封闭剂的接入,改变了整体的表面电位。然而在连接过程中,化学发光的能力虽有减弱但也保留了80% 左右,仍具有很强的发光能力。

N蛋白修饰过程中的材料化学发光和表面电位表征

材料制备和表征之后,研究者们开展了对N蛋白的检测。实验表明,随着N蛋白浓度的升高,化学发光强度逐渐降低,并在20分钟内反应完成,趋于稳定。N蛋白的浓度在0.1 pg / mL - 10 ng / mL浓度的对数与发光强度呈现良好的线性相关性。N蛋白的检测极限是69 fg /mL(S /N =3),远低于之前报道的方法

已发表的检测N蛋白的方法汇总

对N蛋白的检测线性回归方程、选择性以及稳定性检测

为了说明免疫检测是否能选择性检测N蛋白,研究者们选择了IgM、S1、RBD、IgG等干扰蛋白来检测免疫检测的选择性。干扰实验中,所有干扰蛋白的浓度均为1 ng/mL,比N蛋白(0.1 ng/mL)高1个数量级,混合物(MIX)中包含所有干扰蛋白。实验结果可以看出,N蛋白的CL强度明显降低,而干扰蛋白IgM、S1、RBD、IgG的CL反应与空白相似。混合物的CL性能与N蛋白接近,表明探针对N蛋白具有较高的抗体抗原识别选择性。此外,日间检测的相对标准偏差(RSD)在一个月为2.9%,表明所提出的免疫分析具有可观的重复性和稳定性检测N蛋白

临床样本(血清和唾液)回收试验

最后,研究者们对临床试验样品进行了样品回收实验,结果显示,本研究提供的方法测定结果良好,回收率为95.7 ~ 102.9%,证明了所开发的CL免疫测定方法在实际样品中的适用性

总结:针对2019冠状病毒病(COVID-19)大流行中快速准确检测SARS-CoV-2抗原的迫切需要,本研究利用功能化纳米磁珠快速检测N蛋白,30分钟左右即可完成,检测浓度范围:0.1 pg / mL - 10ng / mL,检测限是69 fg /mL。与其他报道的方法相比,具有灵敏度高、选择性强、快速、简单等优点。这种新的合成纳米材料方法和应用策略也可以推广其他抗体检测相对应的蛋白质。

End

参考资料:

[1]https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c03208

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