撰文 | Qi
活细菌疗法（Live bacterial therapeutics,LBT）可以通过植入肠道并在宿主体内提供持久的有益功能来逆转疾病，尤其是包括肥胖症、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等在内的慢性疾病，还可以被设计为表达解决单基因先天性代谢错误（例如苯丙酮尿症患者的苯丙氨酸代谢）的功能【1】。工程化LBT的一个关键步骤是选择微生物底盘，以感知环境、调节基因表达和生产治疗产品。但当前的LBT底盘（如大肠杆菌Nissle 1917、拟杆菌属、乳杆菌属）无法在肠腔环境中移植并存活，难以定位到特定区域如近端肠道，因此功能传递并不可靠【2】。因而适当的底盘选择目前仍是将合成生物学应用转化为人类疾病的重大障碍。
LBT在管腔环境中的生存面临许多挑战，包括来自宿主（如蠕动、先天和适应性免疫）和其他天然微生物（如竞争、生态位可用性）。从理论上讲，“原住民”微生物已经最大限度地适应了宿主肠腔环境，绕过了几乎所有的植入障碍，使其成为转基因传递的理想底盘，但它们又难以培养和修饰。
2022年8月4日，来自加州大学圣地亚哥分校的Amir Zarrinpar团队在Cell杂志上发表了一篇题为Intestinal Transgene Delivery with Native E. coli Chassis Allows Persistent Physiological Changes的文章，他们证明从小鼠粪便培养物中分离的天然大肠杆菌被修饰以表达功能基因，重新引入这些菌株会在肠道中稳定定植并持续表达。这种工程化的大肠杆菌可以在给药数月后诱导影响宿主生理和逆转宿主病理的功能变化。因此，使用原住细菌作为“敲入”特定功能的底盘，可以对宿主中特定微生物活动进行研究，并实现具有治疗目的的LBT。
在本研究中，作者使用了一种天然大肠杆菌EcAZ-1，即一种从杰克逊实验室（Bar Harbor, ME）获得的CR-WT C57BL/6雄性小鼠粪便中分离出来的菌株，通过噬菌体转导将与卡那霉素抗性相关的GFP引入EcAZ-1，以产生可追踪的细菌 EcAZ-2。随后对其进行工程改造生成两种不同的工程化细菌：EcAZ-2 BSH+（胆汁盐水解酶）和EcAZ-2 IL10+。接下来，作者对未经抗生素处理的C57BL/6 小鼠中进行灌胃以评估候选底盘稳定定殖小鼠肠道的能力，EcAZ-2在全部小鼠中稳定维持定植超过110天。随后，作者通过培养胃肠道以确定肠道各个区域的细菌定植程度，与已报道的工程化非天然大肠杆菌相比，EcAZ-2定植于近端肠道/小肠，其中，BSH菌株在盲肠和回肠中的定植最高，而IL-10菌株在盲肠和空肠中的定植最高。此外，从两种小鼠获得的细菌分离物均能检测到BSH和IL-10，说明EcAZ-2可以长期稳定和持续地定植于宿主，同时保留插入基因功能。
图1. 肠道天然大肠杆菌在基因上易于处理，可以作为转基因传递的底盘。
在证明原生细菌在遗传上易于处理并且可以持续定植于近端肠道和结肠后，作者以BSH菌株为例进一步评估了EcAZ-2底盘传递的转基因是否可以在功能上操纵宿主肠腔环境。研究表明由BSH活性引起的胆汁酸变化会影响多种代谢系统，包括葡萄糖、脂质和胆汁酸稳态，以及免疫/炎症和产热【3】，增加的BSH活性会影响所有这些不同的胆汁酸池。作者发现与用 EcAZ-2 定植的小鼠相比，用EcAZ-2 BSH+定植的小鼠具有显着更高的总粪便胆汁酸水平。此外，与用EcAZ-2处理的小鼠相比，用 EcAZ-2 BSH+灌胃的小鼠减少了初级粪便胆汁酸和初级结合胆汁酸等。那么管腔内胆汁酸的变化是否会导致肠道微生物组组成的整体变化呢？微生物组分析表明两组在任何微生物组测量中没有可检测到的差异。因此，尽管诱导了腔内代谢组的变化，但工程化的天然细菌并未诱导肠道微生物组的组成变化。
接下来，作者想知道EcAZ-2 BSH+定植是否会影响宿主生理，于是测量了循环胆汁酸的这些差异对肝脏基因表达的影响，重点关注对胆汁酸代谢重要的基因。结果显示Fxr、Shp和Cyp27a1的表达增加，这与通过替代途径增加的胆汁酸生物合成一致，可能是为了减轻 EcAZ2 BSH+定植的小鼠粪便中胆汁酸的较高排泄。这表明通过工程化的天然细菌将单个基因添加到微生物组中可以显着改变宿主生理。为了确定是否可以使用天然大肠杆菌底盘的转基因递送来改善疾病，作者研究了EcAZ-2 BSH+ 在2型糖尿病遗传模型Ob/Ob小鼠中的作用。尽管体重相同，但在3个多月前接受工程化天然细菌的单次治疗后，与对照组相比，定植EcAZ-2 BSH+的Ob/Ob小鼠的胰岛素敏感性显着改善。因此，这些实验表明，使用天然大肠杆菌进行转基因递送会影响血清代谢组、肠外（例如肝）基因表达、宿主生理学，并在单次给药后数月改善疾病。
最后，为了确定工程化的天然细菌策略是否可以转化为人类，作者从接受常规门诊内窥镜检查的志愿者的胃肠道多个区域的活检中分离出大肠杆菌菌株，并评估了九种分离菌株的抗生素敏感性、通过转导的易处理性等。尽管遗传易处理，但仍需要进一步的研究来确定工程化天然细菌的自体转移是否可以导致人类宿主的长期定植和长期慢性病和遗传疾病的治疗。
总之，这项工作展示了一种简单的、几乎任何实验室都可以完成的技术，以提高利用工程细菌有效改变宿主生理机能的能力。通过将该技术与天然菌株相结合，证明了来自宿主的大肠杆菌可以用作底盘，将特定功能敲入肠道微生物组，单次植入后即可引起持续的生理变化、病理表型的逆转、持续的代谢变化等。如果工程化的天然细菌策略成功开发并转化为人类，它就有可能引入新的治疗性生物治疗药物，从而在不依赖患者依从性的情况下改善慢性病的治疗。
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)00843-1
制版人：十一
参考文献
1. Puurunen, M.K., Vockley, J., Searle, S.L., Sacharow, S.J., Phillips, J.A., 3rd, Denney, W.S., Goodlett, B.D., Wagner, D.A., Blankstein, L., Castillo, M.J., et al. (2021). Safety and pharmacodynamics of an engineered E. coli Nissle for the treatment of phenylketonuria: a first-in-human phase 1/2a study.Nat Metab3, 1125-1132. 10.1038/s42255-021-00430-7.
2. Pedrolli, D.B., Ribeiro, N.V., Squizato, P.N., de Jesus, V.N., Cozetto, D.A., and Team, A.Q.A.U.a.i. (2019). Engineering Microbial Living Therapeutics: The Synthetic Biology Toolbox.Trends in biotechnology37, 100-115. 10.1016/j.tibtech.2018.09.005.
3. Wahlstrom, A., Sayin, S.I., Marschall, H.U., and Backhed, F. (2016). Intestinal Crosstalk between Bile Acids and Microbiota and Its Impact on Host Metabolism.Cell metabolism24, 41-50. 10.1016/j.cmet.2016.05.005.
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